王 曄

（四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064；四川省動物疫病預(yù)防與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064）

豬生殖和呼吸綜合癥病毒(PRRSV)是動脈病毒科、動脈病毒屬的高致病性單正鏈RNA病毒，突變率高。豬群感染該病毒后，主要表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)疾病、流產(chǎn)、以及繼發(fā)性病毒和/或細(xì)菌感染，而且因?yàn)镻RRSV會抑制宿主的免疫系統(tǒng)，故會使宿主處于長期患病狀態(tài)，給全球的養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

PRRSV表達(dá)的蛋白是多功能型的，能有效彌補(bǔ)RNA病毒有限的編碼能力。結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白幾乎都參與調(diào)控宿主免疫系統(tǒng)，躲避宿主的攻擊。目前發(fā)現(xiàn)的調(diào)控機(jī)制已有很多，包括：改變免疫相關(guān)細(xì)胞數(shù)量和功能；促進(jìn)IL-10和TGF-β1表達(dá)使其發(fā)揮免疫抑制功能，進(jìn)而破壞早期炎癥因子與抗炎癥因子的平衡；抑制中和抗體的生成，同時(shí)促進(jìn)非中和抗體合成。

在免疫系統(tǒng)中，TGF-β有維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)定的作用，其主要作用方式是通過依賴于以及不依賴于Smad信號通路調(diào)節(jié)多種白細(xì)胞系的增殖、分化和活性，抑制免疫炎癥因子的功能。已有研究發(fā)現(xiàn)，I型和II型PRRSV均可誘導(dǎo)TGF-β過表達(dá)，使宿主免疫系統(tǒng)失衡、癱瘓，病毒大量繁殖。TGF-β有三個(gè)亞型——TGF-β1～3，其中在免疫系統(tǒng)發(fā)揮主要作用的是 TGF-β1，同IL-10一起發(fā)揮免疫抑制功能。而TGF-β2和TGF-β3則主要在間葉組織和骨骼中大量表達(dá)。Gómez-Laguna等已證實(shí) TGF-β1可以通過抑制IFN-γ合成和促進(jìn)IL-10的表達(dá)來抑制巨噬細(xì)胞的生物活性。

藏豬是一種中國原始高原豬種，具有抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)高寒氣候的特點(diǎn)，與其它豬種在表型和生理特征方面差異明顯。但是因地域原因，目前國內(nèi)外對藏豬免疫遺傳及其免疫應(yīng)答特性的研究較少。PRRSV在四川、西藏地區(qū)流傳十分廣泛，相關(guān)免疫預(yù)防成果不明顯。故本次實(shí)驗(yàn)欲通過RNAi體外轉(zhuǎn)染已被PRRSV感染的藏豬的外周血單核粒細(xì)胞，沉默細(xì)胞中TGF-β1基因的表達(dá)，通過RT-PCR的方法檢測細(xì)胞中PRRSV病毒的復(fù)制情況以及抗病毒免疫應(yīng)答激活情況。

1 材料與方法

1.1 準(zhǔn)備藏豬外周血單個(gè)核細(xì)胞（Tp-PBMCs）

以EDTA-K2抗凝采血管（康健，江蘇）收集藏豬上腔靜脈血。將血液置于豬淋巴細(xì)胞分離液（灝陽，天津）上層，離心（550g，20min）分離得到 Tp-PBMCs。用 Hank’s平衡液（Hyclone，北京）清洗細(xì)胞，再用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 構(gòu)建靶向TGF-β1的 shRNA表達(dá)載體

通過GeneBank獲得豬 TGF-β1 mRNA序列(NM_214015)，利用在線 SiRNA 設(shè)計(jì)軟件（Http：//jura.wi.mit.edu/bioc/siRNA；Http：//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.HtmL）設(shè)計(jì)4條靶向豬TGF-β1 mRNA的干擾序列（表1）。這些序列由Invitrogen公司（上海）合成，并構(gòu)建到shRNA（短發(fā)夾RNA）表達(dá)載體pSilencer 3.1-H1neo中,得到4個(gè)重組質(zhì)粒（shTGFβ1-1～4）。將它們分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增，并經(jīng)酶切和測序（華大基因，北京）驗(yàn)證質(zhì)粒正確性?？蛰d體在豬mRNA數(shù)據(jù)庫（Taxid：9823，NCBI）中沒有靶點(diǎn)，作為空白對照。所有用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒均通過試劑盒純化，并經(jīng)鰲試劑內(nèi)毒素檢測試劑盒（A&C Biological Ltd，湛江）檢測，內(nèi)毒素含量少于0.125 EU/mL。

表1 干擾TGFβ-1的寡核苷酸序列 shTGFβ1-1～4

1.3 重組干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Tp-PBMCs

陽離子脂質(zhì)體DMRIE-C（Invitrogen,USA）作為轉(zhuǎn)染試劑。按照說明書準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染復(fù)合物?；旌衔锘靹蚝笫覝仂o置5min，將稀釋后的質(zhì)粒分別加入稀釋的DMRIE-C中，室溫靜置30min。將Tp-PBMCs 550g離心15min，細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后以RPMI 1640（無血清無抗生素）重懸，密度為1.5×107個(gè)/mL。將0.2mL細(xì)胞懸液（3×106個(gè)細(xì)胞）添加到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后分別加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物并混勻。在培養(yǎng)箱培養(yǎng)4.5h后，加入2mL RPMI 1640培養(yǎng)基和30μL PRRSV，繼續(xù)培養(yǎng)。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)將Tp-PBMCs以10000g離心30s，上清液凍存于-80℃。除質(zhì)粒和病毒外，空白對照組經(jīng)過上述相同的處理。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR引物

Tp-PBMCs細(xì)胞活性由CCK-8試劑盒（7-sea，上海）測定。將3×105經(jīng)處理過的細(xì)胞（PRRSV感染，轉(zhuǎn)染等）加入96孔板，隨后加入CCK8，混勻后培養(yǎng)4h，在酶標(biāo)儀上讀取480nm的吸光值，重復(fù)3次。每個(gè)處理設(shè)置五個(gè)重復(fù)孔。每24h檢測1次。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time qPCR）分析mRNA表達(dá)

將凍存的細(xì)胞從-80℃取出后，按照RNAiso plus說明書提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Transgen，北京）合成cDNA。使用iQ5（BIO-RAD）進(jìn)行real-time qPCR，分析每個(gè)基因的表達(dá)水平。反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變形3min，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（94℃ 6s；退火 6s，72℃ 10s），隨后進(jìn)入溶解曲線循環(huán)（從55℃開始，每6秒增加0.5℃，直至95℃）。重復(fù)三次檢測。TBP（TATA box binding protein）和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶2-beta（Top2-β）作為內(nèi)參基因?；虻南鄬Ρ磉_(dá)量由2-ΔΔCT計(jì)算得出。所有引物的信息列于（表2）中。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，對照組的值都設(shè)為1。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 shTGFβ1-1能抑制感染 PRRSV的 Tp-PBMCs轉(zhuǎn)錄T G F-β1

Tp-PBMCs經(jīng)處理后培養(yǎng)36h（轉(zhuǎn)染結(jié)束時(shí)為0h），收集細(xì)胞，然后通過real-time qPCR的方法檢測TGFβ-1的mRNA水平，篩選4條質(zhì)粒抑制TGF-β1的情況，發(fā)現(xiàn)shTFGβ1-1對TGF-β1的沉默效果最佳，相較PRRSV組，其mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降了74.47%（表3），且抑制時(shí)效長達(dá)72h（表4），因此被選中用于后續(xù)。另外，除空白對照組外，還設(shè)有PRRSV組為陽性對照組，DMRIE-C組和pNeg組均為陰性對照組，前者僅加入轉(zhuǎn)染試劑，后者則向感染PRRSV的細(xì)胞轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體。

另外，為排除假陽性情況，分別用空載體和轉(zhuǎn)染試劑DMRIE-C轉(zhuǎn)染Tp-PBMCs，培養(yǎng)36h后檢測免疫相關(guān)因子的mRNA水平，結(jié)果表明除IFN-α略有升高外，不影響其余免疫相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄（表5）。

2.2 shTGFβ1-1抑制PRRSV的復(fù)制并增強(qiáng)感染PRRSV的Tp-PBMCs的細(xì)胞活性

PRRSV的mRNA水平在感染Tp-PBMCs后的72hpi達(dá)到峰值，在轉(zhuǎn)染shTGFβ1-1后其mRNA水平明顯受到抑制，抑制率高達(dá)99.0%（表4）。

另外，從（表6）可以看出，PRRSV的感染會降低Tp-PBMCs的細(xì)胞活性，而抑制TGF-β1的表達(dá)可以一定程度上恢復(fù)細(xì)胞活性，使活性升高約150%～160%。

表3 重組干擾質(zhì)粒shRNA及對照組對TGF-β1的沉默效果

表4 重組干擾質(zhì)粒shTGFβ1-1對PRRSV復(fù)制和TGF-β1、TGF-β3的mRNA水平的影響

表5 空載體和轉(zhuǎn)染試劑對Tp-PBMCs免疫相關(guān)細(xì)胞因子mRNA水平的影響

表6 重組干擾質(zhì)粒shTGFβ1-1對細(xì)胞活性的影響

2.3 shTGFβ1-1對PRRSV感染的Tp-PBMCs中免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

由于免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況可以反應(yīng)細(xì)胞的免疫應(yīng)答的狀態(tài)，因此本實(shí)驗(yàn)用RT-PCR分析了一些代表性的免疫相關(guān)基因的mRNA水平以推斷shTGFβ1-1對Tp-PBMCs免疫應(yīng)答的調(diào)控情況。

如表4所示，PRRSV感染后會持續(xù)抑制Tp-PBMCs中TGF-β3的表達(dá)，但當(dāng)轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后的前48h其mRNA水平就會有所升高，這可能是其在體外對TGF-β1缺失的一種補(bǔ)償效應(yīng)。

如表7所示，PRRSV感染Tp-PBMCs后會下調(diào)TLR-3的表達(dá)，但轉(zhuǎn)染shTGFβ1-1后72h，其mRNA水平有快速、明顯升高。IFN-α和TNF-α的mRNA水平在PRRSV感染后的前24h處于抑制狀態(tài)，隨即又恢復(fù)到正常水平，轉(zhuǎn)染shTGFβ1-1 72h后，其mRNA轉(zhuǎn)錄就被上調(diào)。伴隨TGF-β1基因表達(dá)的抑制，被PRRSV波動性調(diào)控的IFN-γ的mRNA水平快速升高。與Ctrl組相比，shTGFβ1-1的轉(zhuǎn)錄會明顯上調(diào)IL-2的轉(zhuǎn)錄，但PRRSV感染Tp-PBMCs后對其表達(dá)影響較小。PRRSV感染后會快速誘導(dǎo)IL-8轉(zhuǎn)錄，相反shTGFβ1-1會降低IL-8的mRNA水平。另外，與TGFβ-1同為免疫抑制因子的IL-10在細(xì)胞被PRRSV感染后，轉(zhuǎn)錄水平明顯升高并在感染后72h達(dá)到峰值，但是當(dāng)細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)被沉默后，其mRNA水平相比Ctrl組而言并沒有明顯變化，表達(dá)沒有受到影響。

表7 重組干擾質(zhì)粒shTGFβ1-1對免疫相關(guān)細(xì)胞因子mRNA水平的影響

3 討論

現(xiàn)在已有報(bào)道證實(shí)PRRSV的復(fù)制能夠誘導(dǎo)TGF-β的表達(dá),PRRSV會通過激活Tregs（即Th3亞群）來抑制宿主免疫應(yīng)答，TGF-β是后者的主要效應(yīng)分子。過量表達(dá)的TGF-β1是PRRSV抑制宿主免疫系統(tǒng)的基礎(chǔ)，考慮到它在PRRSV感染宿主細(xì)胞方面的重要地位，本篇欲利用RNAi探究是否可以通過沉默TGF-β1表達(dá)達(dá)到抑制PRRSV復(fù)制和激活被PRRSV抑制的免疫應(yīng)答反應(yīng)。結(jié)果表明，干擾TGF-β1可以成功抑制PRRSV在藏豬外周血單個(gè)核細(xì)胞中的復(fù)制，且抑制率高達(dá)99.0%，同時(shí)使細(xì)胞活性升高約150%～160%，另外成功激活多個(gè)抗病毒免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。這表明TGF-β1在PRRSV復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用，更重要的是，這有可能成為抵抗PRRSV感染的新方法。

TGF-β1是多功能性細(xì)胞因子，破壞其表達(dá)可能會嚴(yán)重影響細(xì)胞功能。已有研究發(fā)現(xiàn)，在體外TGF-β3對TGF-β1的缺失有一定的補(bǔ)償作用。本次試驗(yàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證了這個(gè)說法，轉(zhuǎn)染shTGFβ1-1后，細(xì)胞中TGF-β3的mRNA水平明顯升高。但是升高的TGF-β3是否彌補(bǔ)了免疫抑制功能還需進(jìn)一步試驗(yàn)確定。

IL-8在介導(dǎo)白細(xì)胞遷移至感染部位過程中起重要作用。本篇研究結(jié)果表明，PRRSV感染會快速誘導(dǎo)IL-8表達(dá)升高，這與Reeth等人的研究結(jié)果一致，參與病毒感染更多白細(xì)胞。沉默TFG-β1所引起的IL-8 mRNA水平降低可能與PRRSV復(fù)制被抑制相關(guān)。

研究表明，PRRSV會破壞TLR3的抗病毒能力，以此降低宿主的免疫應(yīng)答能力，本篇研究結(jié)果與之一致。感染PRRSV病毒后，宿主細(xì)胞中TLR3的mRNA水平先降后生，抑制TFG-β1后72h，其mRNA水平快速、明顯升高，表明此時(shí)細(xì)胞開始啟動固有免疫應(yīng)答。

IFN-γ水平宿主與抵抗和清除PRRSV有關(guān)。向已感染病毒的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄shTFGβ1-1后IFN-γ和TNF-α的mRNA水平都有所升高，這可能與效應(yīng)TH1細(xì)胞的抗PRRSV免疫應(yīng)答反應(yīng)被激活有關(guān)。另外，干擾細(xì)胞中TFGβ-1的表達(dá)后，IL-2的mRNA水平明顯升高，這說明TH2免疫應(yīng)答也被激活了。

沉默TFG-β1后，Tp-PBMCs中IL-10的mRNA水平也明顯降低，這可能與細(xì)胞中IFN-γ，IFN-α和TNF-α的大量表達(dá)有關(guān)。

4 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)首次篩選出可以高效、穩(wěn)定地抑制豬外周血單個(gè)核細(xì)胞中TGF-β1基因表達(dá)的重組質(zhì)粒。體外實(shí)驗(yàn)表明，已感染PRRSV的Tp-PBMCS在轉(zhuǎn)染該干擾質(zhì)粒后細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)，抗病毒免疫應(yīng)答被激活，病毒復(fù)制明顯受到抑制。為增強(qiáng)藏豬抵抗PRRSV感染提供了新的研究思路。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大產(chǎn)出科研選題“重大動物疫病新型標(biāo)記疫苗創(chuàng)制”啟動會在哈爾濱召開

2018年6月27日，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大產(chǎn)出科研選題“重大動物疫病新型標(biāo)記疫苗創(chuàng)制”啟動會在哈爾濱獸醫(yī)研究所順利召開。

應(yīng)邀出席會議的有中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技局熊明民副局長、項(xiàng)目處干部解沛；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院財(cái)務(wù)局張士安副局長、姜成鋼副處長。項(xiàng)目參與單位中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所、蘭州獸醫(yī)研究所、上海獸醫(yī)研究所的相關(guān)團(tuán)隊(duì)首席科學(xué)家及主要研究人員近20人參加了本次會議。

項(xiàng)目主持人哈爾濱獸醫(yī)研究所所長步志高研究員從重大動物疫病新型標(biāo)記疫苗創(chuàng)制的重要意義入手，對重大選題研究內(nèi)容、研究目標(biāo)、研究進(jìn)展、實(shí)施方案、實(shí)施機(jī)制、經(jīng)費(fèi)執(zhí)行要求等內(nèi)容進(jìn)行了詳細(xì)的匯報(bào)。熊明民副局長強(qiáng)調(diào)了院重大產(chǎn)出科研選題的立項(xiàng)背景和重要性，并對項(xiàng)目的組織實(shí)施提出具體的指導(dǎo)意見，強(qiáng)調(diào)了項(xiàng)目執(zhí)行過程中要堅(jiān)持產(chǎn)出導(dǎo)向，希望項(xiàng)目成員認(rèn)真完成考核指標(biāo)，產(chǎn)生重大標(biāo)志性成果。

啟動會上，與會專家針對各課題取得的重要進(jìn)展、存在的問題以及項(xiàng)目任務(wù)落實(shí)和組織管理等方面進(jìn)行了充分的討論。