石中全 李國利 胡艷玲 馬麗華

(重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，重慶 404120)

動脈粥樣硬化是一種慢性疾病，能夠誘導(dǎo)高血壓、冠心病等心血管疾病的發(fā)生，是動脈硬化的一種類型，血管壁變厚、管腔減小等是其共同特點[1,2]。有研究顯示，動脈粥樣硬化的發(fā)生與巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞有關(guān)，機體的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞對白細(xì)胞的黏附性增加，在此過程中釋放的趨化因子促使單核細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞，吞噬氧化低密度脂蛋白形成泡沫細(xì)胞[3,4]。Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)存在于免疫細(xì)胞表面，能夠與病原體及其產(chǎn)物相互識別，進而激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌炎癥抑制，發(fā)揮免疫作用[5]。有研究顯示，Toll樣受體4(Toll-like receptor-4，TLR4)參與動脈粥樣硬化過程，在小鼠動脈粥樣硬化組織中表達上調(diào)，能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡[6]。本研究以小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1為研究對象，用ox-LDL處理，體外構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型，并用TLR4特異性阻斷劑抑制巨噬細(xì)胞中TLR4水平，探討TLR4對巨噬細(xì)胞凋亡、炎癥因子等影響，以期為研究動脈粥樣硬化發(fā)生機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、氧化低密度脂蛋白(oxidized LDL，ox-LDL)均購自美國Sigma；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物；細(xì)胞RNA提取試劑盒購自美國Sigma；細(xì)胞蛋白提取試劑盒購自武漢艾美捷；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、TLR4引物由上海生工合成；TLR4單克隆抗體購自美國Abcam；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3)單克隆抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)單克隆抗體、GAPDH單克隆抗體均購自美國CTS；核因子-κBp65(Nuclear factor-κBp65,NF-κBp65)單克隆抗體購自武漢博士德；TNF-α水平檢測試劑盒、IL-6水平檢測試劑盒、IL-1β水平檢測試劑盒均購自美國eBioscience；TLR4阻斷劑TAK-242購自美國APExBio。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 Ana-1細(xì)胞用含有50 ml胎牛血清和450 ml的RPMI1640培養(yǎng)，Ana-1細(xì)胞中加入5 ml的細(xì)胞培養(yǎng)液，700 g離心10 min后，把上清液吸除后，放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Ana-1細(xì)胞分為Con、ox-LDL、TAK-242，其中ox-LDL細(xì)胞用含有50 pg/ml的ox-LDL培養(yǎng)。TAK-242細(xì)胞用含有50 pg/ml ox-LDL和20 μmol/L的TLR4阻斷劑TAK-242培養(yǎng)。Con細(xì)胞用正常細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.2qRT-PCR檢測細(xì)胞中TLR4水平 Con、ox-LDL細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，按照RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的RNA，用EDPC水溶解以后，用紫外分光光度計檢測所提取的RNA純度及濃度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR檢測細(xì)胞中TLR4水平。內(nèi)參基因為GAPDH，2-ΔΔCt法計算TLR4 mRNA水平。程序為：95℃，15 s；60℃，60 s；72℃，30 s；共40個循環(huán)。TLR4上游引物為5′-TGGATACGTTTCCTTATAAG-3′，下游引物5′-GAAATGGAGGCACCCCTTC-3′。GAPDH上游引物為5′-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3′，下游引物5′-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3′。取內(nèi)參和目的基因的Ct值的均值，ΔCt=Ct目的-Ct內(nèi)參，ΔΔCt=(實驗組目的基因Ct值-實驗組內(nèi)參基因Ct值)-(對照組目的基因Ct值-對照組內(nèi)參基因Ct值)。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.3Western blot檢測細(xì)胞中TLR4水平 Con、ox-LDL、TAK-242細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline，PBS)將細(xì)胞洗滌3次，加入裂解液再放在冰上孵育反應(yīng)30 min。4℃，12 000 g離心10 min，將蛋白上清液吸取至EP管中，保存-80℃。吸取5 μl蛋白樣品，用BCA法對蛋白進行定量檢測。蛋白變性：蛋白樣品與5×Loading buffer按照體積比為4∶1的比例混勻后，在沸水中孵育5 min。蛋白電泳：每孔40 μg樣品，10%分離膠，5%濃縮膠電泳，80 V電壓電泳 30 min，120 V電壓觀察marker進入底部后，停止電泳。封閉：5%牛血清白蛋白，37℃孵育1.5 h。一抗結(jié)合：1∶ 800比例稀釋，4℃過夜。二抗孵育：1∶2 000比例稀釋，37℃孵育1.5 h。DAB顯色。以GAPDH為內(nèi)參，分析蛋白水平。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 Con、ox-LDL、TAK-242細(xì)胞培養(yǎng)24 h，離心后，收集約1×106個細(xì)胞，用195 μl的結(jié)合緩沖液懸浮后，依次加入5 μl的碘化丙啶(Propidium iodide，PI)和5 μl膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)，在室溫、避光環(huán)境下孵育10 min，再加入結(jié)合緩沖液190 μl，室溫條件孵育10 min，在60 min內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.5ELISA檢測炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平 Con、ox-LDL、TAK-242細(xì)胞培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中 TNF-α、IL-6、IL-1β水平，步驟參照試劑盒說明書。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.6Western blot檢測Bax、Cleaved Caspase-3、NF-κBp65、TLR4蛋白表達 Con、ox-LDL、TAK-242細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測細(xì)胞中Bax、Cleaved Caspase-3、NF-κBp65、TLR4水平。Bax、Cleaved Caspase-3、NF-κBp65、TLR4一抗分別以1∶800、1∶600、1∶600、1∶800 稀釋。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.7DCFH-DA法檢測ROS水平 Con、ox-LDL、TAK-242細(xì)胞培養(yǎng)24 h，按照ROS水平檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)的ROS水平(DCFH-DA法)，用ox-LDL和TAK-242細(xì)胞的熒光強度除以 Con表示ROS水平，實驗重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1ox-LDL作用后巨噬細(xì)胞中TLR4表達水平升高 結(jié)果如圖1所示，ox-LDL細(xì)胞中TLR4 mRNA和蛋白水平均明顯高于Con，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ox-LDL作用后巨噬細(xì)胞中TLR4表達水平增加。

2.2阻斷TLR4減弱ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡 結(jié)果如圖2所示，ox-LDL和TAK-242細(xì)胞凋亡率明顯高于Con，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TAK-242細(xì)胞凋亡率明顯低于ox-LDL，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，而阻斷TLR4能夠降低ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。

圖1 ox-LDL作用后巨噬細(xì)胞中TLR4 mRNA的蛋白水平Fig.1 Protein levels of TLR4 mRNA in macrophages after ox-LDL treatmentNote:A.TLR4 mRNA level;B.Detection of TLR4 protein expression in cells by Western blot;C.TLR4 protein level.Compared with Con,t1=18.558，t2=4.082，*.P<0.05.

2.3阻斷TLR4降低ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6、IL-1β 結(jié)果如圖3所示，ox-LDL和TAK-242細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯高于Con，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TAK-242細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯低于ox-LDL，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子，而阻斷TLR4能夠降低ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子。

圖2 阻斷TLR4對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡影響Fig.2 Effect of blocking TLR4 on ox-LDL induced apoptosis in macrophagesNote:A.Flow cytometry was used to detect apoptosis;B.Apoptosis rate.Compared with Con,t1=16.277，t2=9.738，*.P<0.05;compared with ox-LDL,t=6.539，#.P<0.05.

圖3 阻斷TLR4對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β影響Fig.3 Effect of blocking TLR4 on TNF-α,IL-6 and IL-1β secreted by macrophages induced by ox-LDLNote:A.TNF-α content;B.IL-1β content;C.IL-6 content.Compared with Con,t1=24.493，t2=11.113，t3=18.817，t4=10.162，t5=13.847，t6=4.931，*.P<0.05;compared with ox-LDL,t1=13.380，t2=8.656，t3=8.917，#.P<0.05.

圖4 Western blot檢測Bax、Cleaved Caspase-3水平Fig.4 Bax,Cleaved Caspase-3 levels detected by Western blot

GroupsBaxCleavedCaspase?3Con0 36±0 040 41±0 06 Ox?LDL1 25±0 131)1 11±0 091) TAK?2420 57±0 051)2)0 78±0 081)2) F92 75760 978P0 0000 000

Note：Compared with Con,t1=13.028，t2=3.074，t3=11.037，t4=5.834，1)P<0.05;compared with ox-LDL,t1=9.954，t2=5.203，2)P<0.05.

2.4阻斷TLR4對ox-LDL作用后巨噬細(xì)胞中Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達影響 結(jié)果如圖4和表1所示，ox-LDL和TAK-242細(xì)胞Bax、Cleaved Caspase-3水平明顯高于Con，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TAK-242細(xì)胞Bax、Cleaved Caspase-3水平明顯低于ox-LDL，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中Bax、Cleaved Caspase-3表達，而阻斷TLR4能夠降低巨噬細(xì)胞中Bax、Cleaved Caspase-3水平。

2.5阻斷TLR4降低ox-LDL作用后巨噬細(xì)胞中ROS水平 結(jié)果圖5所示，ox-LDL和TAK-242細(xì)胞ROS水平明顯高于Con，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TAK-242細(xì)胞ROS水平明顯低于ox-LDL，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中ROS水平升高，而阻斷TLR4能夠降低巨噬細(xì)胞ROS水平。

2.6阻斷TLR4降低ox-LDL后巨噬細(xì)胞中NF-κBp65、TLR4水平 結(jié)果如圖6和表2所示，ox-LDL和TAK-242細(xì)胞NF-κBp65、TLR4水平明顯高于Con，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TAK-242細(xì)胞NF-κBp65、TLR4水平明顯低于ox-LDL，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中NF-κBp65表達，而阻斷TLR4能夠降低巨噬細(xì)胞中NF-κBp65水平。

圖5 細(xì)胞中ROS水平Fig.5 Level of ROS in cellsNote:Compared with Con,t1=10.394，t2=3.922,*.P<0.05;compared with ox-LDL,t=6.472,#.P<0.05.

圖6 Western blot檢測細(xì)胞中NF-κBp65、TLR4表達水平Fig.6 Expression levels of NF-κBp65 and TLR4 in cells were detected by Western blot

GroupsTLR4NF?κBp65 Con0 21±0 020 14±0 02 Ox?LDL0 64±0 071)1 54±0 061) TAK?2420 35±0 031)2)0 82±0 061)2) F 69 823 580 421P 0 000 0 000

Note：Compared with Con,t1=11.585，t2=3.772，t3=34.067，t4=16.547，1)P<0.05;compared with ox-LDL,t1=7.813，t2=17.520，2)P<0.05.

3 討論

TLRs為跨膜蛋白，其胞內(nèi)區(qū)可與白細(xì)胞介素受體的TIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而胞外域由多個重復(fù)的富含亮氨酸的序列組成，在免疫炎癥反應(yīng)中具有重要作用[7-10]。動脈粥樣硬化以慢性炎癥為主要病理變化，免疫細(xì)胞積聚于動脈壁為特征[11,12]。研究顯示，內(nèi)皮細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等均能夠表達TLRs，能夠調(diào)控動脈粥樣硬化發(fā)生過程[13-15]。很多報道顯示，TLR4與動脈粥樣硬化有關(guān)。Edfeldt等[16]研究顯示，TLR4在動脈粥樣硬化斑塊中的表達水平明顯上調(diào)，并且是通過TLR4的識別作用使動脈粥樣硬化相關(guān)因子大量釋放。還有研究顯示，用TLR4激活劑可以誘導(dǎo)動脈粥樣硬化斑塊的形成，誘導(dǎo)血管重構(gòu)[17]。本研究用ox-LDL處理巨噬細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中的TLR4基因轉(zhuǎn)錄水平升高，細(xì)胞中TLR4蛋白水平也升高，這提示，TLR4參與動脈粥樣硬化發(fā)生，與上述實驗報道相符合。

在動脈粥樣硬化發(fā)生過程中，巨噬細(xì)胞攝取了ox-LDL攜帶的膽固醇，能夠沉積在動脈血管上，導(dǎo)致脂肪條紋的形成，而活化的巨噬細(xì)胞釋放的炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β和ROS等，增加炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)脂蛋白的氧化，又會進一步加快動脈粥樣硬化發(fā)生，此外ROS也是心血管系統(tǒng)中重要的致病因子[18-20]。本研究顯示，ox-LDL處理后的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高，細(xì)胞中ROS水平也升高，說明ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6、IL-1β，促進細(xì)胞中ROS表達，而用TLR4阻斷劑降低巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β，降低細(xì)胞中ROS水平，阻斷TLR4抑制ox-LDL作用后的巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子，降低細(xì)胞中ROS水平。

在動脈粥樣硬化斑塊組織中，巨噬細(xì)胞大量凋亡，而巨噬細(xì)胞凋亡增多后又會進一步引起動脈粥樣硬化斑塊組織不穩(wěn)定[21-23]。細(xì)胞凋亡的發(fā)生受到多種基因的嚴(yán)格調(diào)控，是一個復(fù)雜過程，其中Caspase蛋白家族和Bcl-2蛋白家族與細(xì)胞凋亡有關(guān)[24-26]。Caspase-3屬于Caspase家族成員之一，其活化后形成Cleaved Caspase-3促進細(xì)胞凋亡的發(fā)生[27,28]。Bax是Bcl-2蛋白家族中的一員，是一種促凋亡蛋白[29]。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，促進細(xì)胞中Caspase-3活化，誘導(dǎo)細(xì)胞中Bax表達，而阻斷TLR4可以減弱ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。說明阻斷TLR4不僅可以減少巨噬細(xì)胞炎癥因子釋放，還可以抑制巨噬細(xì)胞凋亡。

NF-κB在多種組織和器官中均有表達，能夠調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，是一種核轉(zhuǎn)錄因子[30,31]。研究顯示，NF-κB參與動脈粥樣硬化過程，在單核細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞中表達,正常情況下，NF-κB可以與IκB結(jié)合以二聚體的形式存在，在受到缺氧、細(xì)胞因子等的刺激后，IκB磷酸化后被降解，NF-κB活化從細(xì)胞漿內(nèi)進入到核內(nèi)，與基因操縱子結(jié)合，誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄[32-35]。NF-κB對細(xì)胞中促炎因子、趨化因子等的表達具有關(guān)鍵調(diào)控作用，與動脈粥樣硬化的炎癥有關(guān)，其激活后促進動脈粥樣硬化發(fā)生，NF-κBp65是NF-κB激活后存在的主要方式[36-40]。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL作用后，巨噬細(xì)胞中NF-κBp65水平升高，而阻斷TLR4后可以抑制ox-LDL的這一作用。

綜上，TLR4參與動脈粥樣硬化發(fā)生過程，在ox-LDL作用后的巨噬細(xì)胞中表達上調(diào)。阻斷TLR4后，可以降低ox-LDL作用后的巨噬細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞分泌炎癥因子，減弱細(xì)胞中ROS水平，降低細(xì)胞中NF-κBp65水平，TLR4在動脈粥樣硬化泡沫細(xì)胞中具有重要作用，對于研究動脈粥樣硬化的發(fā)生具有重要意義，其作用機制仍然需要在動物實驗及多種巨噬細(xì)胞中進行驗證。