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        IL-38通過上調(diào)CXCL1及IL-8募集中性粒細胞促進轉(zhuǎn)移病灶的形成研究

        2018-08-01 04:07:22
        中國免疫學雜志 2018年7期
        關鍵詞:小鼠水平研究

        岳 曼 朱 磊 李 軍

        (武漢市中心醫(yī)院腫瘤Ⅱ病區(qū),武漢 430025)

        腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征,是引起癌癥患者死亡的首要因素[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生涉及腫瘤細胞及其所處微環(huán)境中復雜的信號通路,這些信號通路的激活及相互作用介導了腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲和在血液/淋巴循環(huán)系統(tǒng)中的存活,以及在轉(zhuǎn)移靶部位的生長過程[2]。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復雜的、多因素調(diào)控的動態(tài)過程,對于腫瘤轉(zhuǎn)移機制的研究將有助于深入了解轉(zhuǎn)移過程,并尋找有意義的治療靶標,為臨床診斷和治療奠定基礎[3]。趨化因子CXCL1(C-X-C motif chemokine ligand 1)又稱為黑色素瘤生長刺激因子或生長調(diào)節(jié)性癌基因α,是一類與細胞相關的ELR+(吸引中性粒細胞及誘導血管新生)CXC族趨化因子[4]。研究表明,CXCL1可結合并激活CXC趨化因子受體2(CXCR2),活化PI3K信號通路,從而介導上皮細胞間質(zhì)化(Epithelial-mesenchy-mal transition,EMT)的發(fā)生[5]。報道指出,CXCL1在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮關鍵作用[6,7]。人IL-8屬于趨化因子CXC(α)亞家族成員,又稱CXC趨化因子8[8]。IL-8的細胞來源廣泛,生理或病理的多種細胞刺激均可以引發(fā)細胞表達IL-8。研究指出,IL-8在腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用,阻斷IL-8或其受體不但可減輕炎癥反應,而且可抑制腫瘤細胞的增殖[9,10]。IL-38是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞因子,其生物學功能尚未十分明確。IL-38是IL-36的部分受體拮抗劑,可作為IL-36的特異性受體[11]。報道指出,IL-38可抑制Th17細胞產(chǎn)生IL-17和IL-22等炎癥介質(zhì),也可抑制IL-36γ誘導產(chǎn)生IL-8,發(fā)揮抑制炎癥反應的作用[11]。據(jù)作者所知,目前尚無報道研究IL-38與腫瘤轉(zhuǎn)移之間的關聯(lián)。本次研究的目的是分析腫瘤患者腫瘤組織中IL-38的表達水平,并探討其對腫瘤轉(zhuǎn)移病灶形成的影響。

        1 資料與方法

        1.1資料

        1.1.1資料來源 本次研究共納入2009年1月~2014年12月我院收治的32例轉(zhuǎn)移性腫瘤患者及62例原位癌患者作為研究對象;所有患者中男性41例,女性53例;患者的年齡27~72歲,平均(47.3±12.6)歲。所有患者的原發(fā)病灶均經(jīng)病理證實。所有患者均未經(jīng)任何治療。轉(zhuǎn)移性腫瘤患者均為肺轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移灶經(jīng)胸部X線片、CT或MRI證實。所有肺轉(zhuǎn)移性腫瘤患者均為原發(fā)腫瘤與肺轉(zhuǎn)移瘤同期發(fā)現(xiàn)患者。單個轉(zhuǎn)移病灶5例、多發(fā)轉(zhuǎn)移灶27例。單發(fā)肺轉(zhuǎn)移瘤23例,腫瘤平均直徑(3.2±2.7)cm;雙發(fā)肺轉(zhuǎn)移瘤9例,腫瘤平均直徑(2.5±1.7)cm。肺轉(zhuǎn)移性腫瘤患者中,原發(fā)腫瘤為癌的患者共24例,其中結、直腸癌12例,腎癌6例,賁門癌3例,絨癌3例;原發(fā)腫瘤為肉瘤的患者共8例,其中纖維肉瘤5例,滑膜肉瘤3例。排除臨床資料不完整的患者;排除近期及長期服用影響機體免疫藥物的患者;排除長期營養(yǎng)不良患者;排除長期臥床患者;排除伴有全身其他器官器質(zhì)性疾病患者。另選取43例同期在我院體檢中心進行體檢的健康人員作為對照;對照組患者中男性19例,女性24例;患者年齡19~78歲,平均(48.7±16.3)歲。納入研究的患者均告知本研究的目的及方法,所有患者均簽署知情同意書,研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

        1.1.2材料與設備 主要試劑包括人IL-38 ELISA試劑盒(美國R&D Systems),IL-38、CXCL1、IL-8抗體(美國Abcam公司),p-MEK、MEK、p-ERK、ERK抗體(美國Santa Cruz公司),β-actin抗體(武漢三鷹生物技術有限公司),LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Fisher),SDS-PAGE試劑(上海碧云天生物技術有限公司),RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國TaKaRa公司),Realtime-PCR試劑(南京諾唯贊生物科技有限公司),CXCL1及IL-18引物(上海生工生物工程股份有限公司),CXCR2特異性抑制劑(美國Selleckchem公司),IL-18BP(北京中美生物技術有限公司),DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司),青霉素、鏈霉素(美國Sigma公司),C57小鼠購自武漢大學實驗動物中心,B16F1及B16F0細胞購自美國ATCC公司。主要設備包括CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺、Tecan酶標儀、Bio-Rad垂直電泳儀,Bio-Rad Western blot化學發(fā)光成像系統(tǒng)

        1.2方法

        1.2.1小鼠模型的建立 取對數(shù)生長期的B16F1與B16F0細胞,胰酶消化,1 000 r/min離心收集細胞,加PBS重懸,將細胞密度調(diào)整為1×107ml-1。經(jīng)小鼠尾靜脈注射1×106個細胞/只,建立B16F1與B16F0細胞肺轉(zhuǎn)移模型。

        1.2.2質(zhì)粒構建與小鼠分組 構建pCMV-IL-38及pCMV-GFP質(zhì)粒。用20 μl OPTIMEN培養(yǎng)基稀釋1 μl LipofectamineTM2000脂質(zhì)體。分別用50 μl OPTIMEN培養(yǎng)基稀釋1 μg pCMV-IL-38和pCMV-GFP質(zhì)粒。將質(zhì)粒與脂質(zhì)體按1∶2.5的比例混合,室溫放置20 min,待用。分別將B16F1和B16F0肺轉(zhuǎn)移小鼠隨機分為三組,每組10只,前兩組小鼠分別肝臟轉(zhuǎn)染pCMV-IL-38和pCMV-GFP質(zhì)粒,將制備好的轉(zhuǎn)染液進行肝靜脈注射轉(zhuǎn)染,第三組在轉(zhuǎn)染pCMV-IL-38質(zhì)粒的基礎上尾靜脈注射CXCL1抑制劑(CXCR2特異性抑制劑)和IL-18抑制劑(IL-18BP)。小鼠肝臟轉(zhuǎn)染4周后處死全部小鼠,分離肺組織,觀察轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。另取部分組織進行生化指標檢測。

        1.2.3免疫組化染色 將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)高壓鍋抗原熱修復,加3%H2O2室溫避光孵育30 min,PBS洗 5 min×3次。采用SP法檢測COX-2、PD-1、CD8及Foxp3水平。即用10%正常非免疫羊血清37℃孵育60 min,滴加一抗工作液4℃冰箱過夜,PBS洗5 min×3次。滴加二抗工作液,37℃孵育60 min,PBS洗5 min×3次。滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素,37℃孵育60 min,PBS洗5 min×3次。DAB顯色、蘇木素復染、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。每個切片隨機選取5個視野,顯微鏡下觀察染色陽性細胞所占百分比。

        1.2.4Real-time PCR 取小鼠肺組織進行碾磨,嚴格按照產(chǎn)品說明書的步驟進行總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和PCR,取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。CXCL1的上游引物序列:5′-ACTCAAGAATGGTCGCGAGG-3′,下游引物序列:5′-GTGCCATCAGAGCAGTCTGT-3′;IL-38的上游引物序列:5′-CTAGGCATCTTCGTC-CGTCC-3′,下游引物序列:5′-TTCACCCATGGAGC-ATCAGG-3′;內(nèi)參β-actin的上游引物序列:5′-GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3′,下游引物序列:5′-ACGACCAGAGGCATACAGG-3′。PCR循環(huán)條件:95℃ 30 s預變性,95℃ 5 s,60℃ 30 s共40個循環(huán)。

        1.2.5Western blot 取小鼠肺組織進行碾磨,RIPA裂解液(含1%PMSF蛋白酶抑制劑)裂解細胞提取總蛋白,測定蛋白濃度。配置12%的分離膠和5%的濃縮膠,每孔上樣80~120 μg蛋白進行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)至PVDF膜。經(jīng)5%BSA封閉后,加一抗4℃孵育過夜。經(jīng)洗滌,加二抗(凱基生物公司)室溫孵育1 h。洗滌后,DBA顯色。

        2 結果

        2.1患者的基本信息 研究初期共納入41例轉(zhuǎn)移性腫瘤患者及67例原位癌患者,其中7例臨床資料不完整,3例近期服用影響機體免疫的藥物,2例長期營養(yǎng)不良患者,1例長期臥床,1例伴有其他器官器質(zhì)性疾病。最終納入研究的32例轉(zhuǎn)移性腫瘤患者及62例原位癌患者的基本資料如表1所示,兩組患者的年齡、性別等基本資料相比均無統(tǒng)計學差異(P>0.05),具有可比性。

        2.2患者的血清IL-38及組織IL-38、CXCL1、IL-8水平分析 如圖1所示,ELISA結果表明,肺轉(zhuǎn)移腫瘤患者的血清IL-38水平[(73.2±11.6)pg/ml]顯著高于原位癌[(46.1±10.9)pg/ml]及健康者[(15.8±3.5)pg/ml](P<0.05)。免疫組化結果顯示,肺轉(zhuǎn)移腫瘤患者腫瘤組織中的IL-38、CXCL1及IL-8水平均顯著高于原位癌患者(P<0.05)。

        表1患者基本信息對比

        Tab.1CompareofbasicdataandserumIL-38levelbetweendifferentgroups

        ItemsTumormetastaticgroup(n=32)Carcinomainsitugroup(n=62)tvalue(χ2value)PvalueAge47 1±13 846 3±10 90 3070 759Male[n(%)]15(46 8)26(41 9)0 2090 647Primarytumordiameter(cm)5 3±1 65 7±2 10 9440 347Primarytumortype[n(%)]Colorectalcancer12(37 5)22(35 5)0 0370 847Renalcarcinoma6(18 8)12(19 4)0 0050 944Cardiacarcinoma3(9 4)6(9 7)0 0020 962Choriocarcinoma3(9 4)7(11 3)0 0810 775Fibrosarcoma5(15 6)9(14 5)0 0200 886Synovialsarcoma3(9 4)5(8 1)0 0470 829Other0(0 0)1(1 6)0 5220 470

        2.3小鼠模型的建立與分析 小鼠尾靜脈注射B16F1與B16F0細胞后所有小鼠均成功建模。肝臟轉(zhuǎn)染IL-38后,B16F1與B16F0細胞在小鼠肺部形成的轉(zhuǎn)移病灶數(shù)量均顯著多于對照組(P<0.05)。免疫組化結果顯示, IL-38轉(zhuǎn)染能顯著增加B16F1與B16F0肺轉(zhuǎn)移模型小鼠的肺組織中性粒細胞浸潤(P<0.05)。

        圖1 各組IL-38、CXCL1與IL-8表達水平分析Fig.1 Expression of IL-38,CXCL1 and IL-8 in different groupNote:A.Serum level of IL-38;B,C.IHC analysis of IL-38,CXCL1 and IL-8 level in tumor tissue.**.P<0.001.

        圖2 IL-38轉(zhuǎn)染對小鼠肺組織CXCL1及IL-8表達量的影響Fig.2 Effect of IL-38 transfection on expression of CXCL1 and IL-8Note:A.mRNA level of CXCL1 and IL-8;B.Protein level of CXCL1 and IL-8.**.P<0.001 compared with vector transfection group.

        2.4IL-38對CXCL1及IL-8的影響 Realtime-PCR結果顯示,IL-38轉(zhuǎn)染能顯著增加小鼠肺組織中CXCL1及IL-8的mRNA水平(P<0.05)。Western blot結果顯示IL-38轉(zhuǎn)染能顯著增加小鼠肺組織中CXCL1及IL-8的蛋白水平(P<0.05),如圖2所示。同時,給予CXCL1及IL-8抑制劑能顯著抑制IL-38引起的小鼠肺部病灶數(shù)增加和中性粒細胞浸潤(P<0.05)(圖3)。

        2.5IL-38對MEK/ERK信號通路的影響 Western blot結果顯示,IL-38轉(zhuǎn)染能顯著上調(diào)肺轉(zhuǎn)移小鼠模型肺組織中CXCL1、IL-8的表達及MEK、 ERK的磷酸化水平(P<0. 05), 且給予CXCL1及IL-8抑制劑能顯著抑制IL-38對MEK、ERK磷酸化的影響(P<0.05),見圖4。

        圖3 小鼠模型肺轉(zhuǎn)移灶及中性粒細胞浸潤分析Fig.3 Analysis of metastatic foci and neutrophil infiltration in mice modelNote:A.Number of metastatic foci in different group;B.Neutrophil infiltration in different group(HE staining).**.P<0.001 compared with vector transfection group;##.P<0.001 compared with IL-38 transfection group.

        圖4 IL-38轉(zhuǎn)染對小鼠肺組織MEK及ERK磷酸化水平的影響Fig.4 Effect of IL-38 transfection on phospholation level of MEK and ERK

        3 討論

        本次研究的目的是分析腫瘤患者腫瘤組織中IL-38的表達水平,并探討其對腫瘤轉(zhuǎn)移病灶形成的影響。IL-38于2001年首次被發(fā)現(xiàn),其基因位于人2號染色體上,位于編碼IL-1Ra和IL-36Ra的基因旁[12]。IL-38在免疫組織中廣泛表達,如脾、胸腺、扁桃體等[11]。IL-38能與IL-36的受體相關蛋白類型2(IL-1Rrp2)結合。IL-38與IL-1Ra及IL-36Ra的氨基酸組成具有較高的同源性,因此推測IL-38可能作為IL-1的受體拮抗劑,其生物學功能與IL-36Ra類似[13]。最近的研究發(fā)現(xiàn),IL-38對免疫細胞的生物學作用與IL-36受體拮抗劑類似,且與一些自身免疫性疾病如強直性脊柱炎和關節(jié)型銀屑病有著密切的關系[11]。

        本次研究中肺轉(zhuǎn)移腫瘤患者的血清及腫瘤組織中的IL-38水平均顯著高于原位癌及健康者。小鼠模型的研究顯示,IL-38能促進B16F1與B16F0肺轉(zhuǎn)移模型小鼠的肺組織中性粒細胞浸潤,進而促使肺部轉(zhuǎn)移病灶的形成。這些結果提示IL-38在腫瘤肺轉(zhuǎn)移的生理過程中扮演重要角色。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復雜的、多因素調(diào)控的動態(tài)過程,對于腫瘤轉(zhuǎn)移機制的研究將有助于深入了解轉(zhuǎn)移過程,并可以鑒定到有意義的治療靶標,為臨床診斷和治療奠定基礎[1,2]。腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征,是引起癌癥患者死亡的首要因素,腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生涉及到腫瘤細胞及其所處的微環(huán)境中的復雜信號通路,這些信號通路的激活及相互作用介導了腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲和在血液/淋巴循環(huán)系統(tǒng)中存活,以及在轉(zhuǎn)移靶部位的生長過程[2]。

        IL-8是一種具有趨化作用和促血管生成作用的炎性細胞因子[8,10]。研究表明,惡性腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、腫瘤相關巨噬細胞、單核細胞及中性粒細胞浸潤過程中均出現(xiàn)IL-8及其受體表達的增加[14]。腫瘤細胞高表達IL-8,從而誘導中性粒細胞趨化,并促使巨噬細胞分泌腫瘤相關生長因子,促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移[15]。CXCL1最初于黑色素瘤上清液中分離獲得,通過與受體CXCR2特異性結合而發(fā)揮多種生物學功能,如血管生成、炎癥、傷口愈合以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等[5,7]。CXCL1過表達能顯著增加遷移相關蛋白(如MMP2、integrin β1等)的表達水平[16]。本次研究中,肺轉(zhuǎn)移腫瘤患者腫瘤組織中CXCL1與IL-8水平均顯著高于原位癌患者;IL-38轉(zhuǎn)染能顯著增加小鼠肺組織中CXCL1及IL-8的mRNA與蛋白水平;給予CXCL1及IL-8抑制劑能顯著抑制IL-38引起的小鼠肺部病灶數(shù)增加和中性粒細胞浸潤。這些結果提示CXCL1與IL-8在IL-38上調(diào)中性粒細胞促進腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用。

        近期研究指出,MAPK/ERK信號通路在CXCL1與IL-8發(fā)揮促腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關鍵作用[17]。本次研究中IL-38能顯著增加肺轉(zhuǎn)移小鼠模型肺組織中MEK與ERK的磷酸化水平,且給予CXCL1及IL-8抑制劑能顯著抑制IL-38對MEK、ERK磷酸化的影響。

        綜上所述,本次研究表明肺轉(zhuǎn)移腫瘤患者的血清和腫瘤組織中IL-38、CXCL1與IL-8水平均發(fā)生顯著升高,IL-38可能通過上調(diào)CXCL1、IL-8及MEK、ERK的磷酸化水平募集中性粒細胞,從而促進轉(zhuǎn)移病灶的形成。

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