陳禹宏 孟 瑩 胡麗娜

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400010)

宮頸癌是全球女性中僅次于乳腺癌的最常見的婦科惡性腫瘤，是發(fā)展中國家婦女的主要死亡原因之一，其發(fā)病率居女性生殖道惡性腫瘤的首位[1-3]。Wnt/β-catenin信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，在調(diào)節(jié)正常細(xì)胞生長、運動、分化以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中都發(fā)揮著重要作用。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路中關(guān)鍵分子，Wnt/β-catenin信號通路的活化由細(xì)胞胞質(zhì)中β-catenin的蛋白水平?jīng)Q定[4-6]。MARCH8(Membrane-associated RING-CH 8)是具有特定環(huán)指結(jié)構(gòu)域的膜相關(guān)RING-CH家族的一員。MARCH8包含兩個跨膜區(qū)和一個位于胞漿端的特定環(huán)指結(jié)構(gòu)域，在人的多種正常組織中均有表達(dá)，并且在人體免疫系統(tǒng)中有重要作用。據(jù)研究，過度表達(dá)MARCH8將導(dǎo)致一些細(xì)胞黏附分子和抗原遞呈分子的表達(dá)下調(diào)，這其中包括CD44、CD88、MHCⅡ和CD166等[7-9]。然而，在MARCH8對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響和可能的作用機制方面，尚未見報道。為進(jìn)一步探索MARCH8與宮頸癌的關(guān)系，本研究首次探討了MARCH8基因?qū)m頸癌細(xì)胞侵襲、遷移、增殖和克隆能力的影響及其可能的作用機制，以期為宮頸癌發(fā)生機制的探究與新的分子靶點的治療提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 胎牛血清和RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。全RNA快速提取試劑盒購自北京百泰克公司。RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR-Green RT-PCR reaction mix試劑盒購自美國Bio-Rad公司。轉(zhuǎn)染試劑盒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。Transwell小室購自美國Corning公司。CCK-8試劑盒、ECL試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌Siha細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。 宮頸癌Siha細(xì)胞用完全培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基)進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞放置于溫度37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫孵箱中培養(yǎng)，并常規(guī)傳代。

1.2.2siRNA轉(zhuǎn)染至Siha細(xì)胞 取對數(shù)生長期的宮頸癌Siha細(xì)胞，接種于6孔板中，用不含青鏈霉素的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度為50%左右時，按轉(zhuǎn)染試劑盒中的說明書將siRNA-MARCH8和siRNA-NC轉(zhuǎn)染至宮頸癌Siha細(xì)胞中。

1.2.3Transwell法 收集siRNA-MARCH8和siRNA-NC轉(zhuǎn)染48 h后的宮頸癌Siha細(xì)胞，接種于24孔板里的Transwell小室上室中，每孔細(xì)胞數(shù)約為1.0×105個。將200 μl無血清培養(yǎng)基加入至Transwell小室的上室，500 μl完全培養(yǎng)液加入至下室中，而后37℃培養(yǎng)48 h。取出24孔板，將膜的下表面細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min后，用0.5%結(jié)晶紫進(jìn)行染色。待干后，在倒置顯微鏡中進(jìn)行拍照，并且隨機選取3個視野，計算侵襲后的平均細(xì)胞數(shù)。

1.2.4劃痕愈合實驗 收集siRNA-MARCH8和siRNA-NC轉(zhuǎn)染48 h后的宮頸癌Siha細(xì)胞接種于6孔板中，待培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為100%時，用移液器槍頭均勻地畫出3條直線。用PBS液洗3次后，加入1%血清培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡中拍照，測定0 h時劃痕的寬度。而后37℃培養(yǎng)48 h時，終止培養(yǎng)，并在倒置顯微鏡中拍照。

1.2.5CCK8 收集siRNA-MARCH8和siRNA-NC轉(zhuǎn)染48 h后的宮頸癌Siha細(xì)胞，接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約為2.0×103個。待細(xì)胞培養(yǎng)至1、2、3、4 d后，加入CCK-8溶液10 μl,繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，450 nm處檢測各孔的吸光度(D)值。

1.2.6細(xì)胞克隆法 收集siRNA-MARCH8和siRNA-NC轉(zhuǎn)染48 h后的宮頸癌Siha細(xì)胞，接種于6孔板中，每個孔約1 000個細(xì)胞，置于溫度37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫孵箱中培養(yǎng)14 d，中間每隔4 d換一次完全培養(yǎng)液。待培養(yǎng)至14 d時，肉眼可見形成的細(xì)胞集落。終止培養(yǎng)，用4%多聚甲醛固定15 min后，用0.5%結(jié)晶紫進(jìn)行染色。待干后，在顯微鏡下觀察。

1.2.7Real-time PCR 收集siRNA-MARCH8和siRNA-NC轉(zhuǎn)染后的宮頸癌Siha細(xì)胞，用全RNA快速提取試劑盒提取細(xì)胞總的RNA，并檢測RNA純度。采用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。隨后，依據(jù)試劑盒說明，以合成的cDNA為模板，擴增目的基因。

1.2.8蛋白質(zhì)印跡法 收集細(xì)胞，按照試劑說明書提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，并用BCA法測定蛋白濃度。按照凝膠試劑盒說明書制備好凝膠后，進(jìn)行SDS-PAGE以分離蛋白，通過電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜后，用5%的脫脂奶粉在室溫下封閉2 h，加入一抗后并放置于4℃冰箱中過夜。隨后加入二抗，在室溫下孵育2 h。最后進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果

2.1siRNA-MARCH8轉(zhuǎn)染后Siha細(xì)胞中MARCH8的表達(dá)下調(diào) Real-time PCR結(jié)果(圖1A)和蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果(圖1B)顯示，與轉(zhuǎn)入siRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)入siRNA1-MARCH8組和siRNA2-MARCH8組細(xì)胞中MARCH8 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下降(P值均<0.05)。以上結(jié)果說明，siRNA-MARCH8對宮頸癌Siha細(xì)胞的轉(zhuǎn)染是有效的，能成功降低細(xì)胞中MARCH8 mRNA和蛋白表達(dá)水平，其中，siRNA1-MARCH8的轉(zhuǎn)染效率更好，因此后續(xù)實驗用siRNA1-MARCH8對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2.2下調(diào)MARCH8表達(dá)對宮頸癌Siha細(xì)胞的侵襲、增殖以及遷移能力的影響 Transwell實驗檢測結(jié)果顯示(圖2A)，與轉(zhuǎn)入siRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)入siRNA1-MARCH8組穿過小室膜的細(xì)胞明顯減少(P<0.05)。CCK8結(jié)果顯示(圖2B),培養(yǎng)細(xì)胞至第2天時，轉(zhuǎn)入siRNA1-MARCH8組的細(xì)胞生長速度明顯低于轉(zhuǎn)入siRNA-NC組。在培養(yǎng)至第3天，第4天時，轉(zhuǎn)入siRNA1-MARCH8組與陰性對照組細(xì)胞生長速度仍有明顯差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。劃痕實驗結(jié)果顯示(圖2C)，劃痕48 h后，轉(zhuǎn)入siRNA1-MARCH8組劃痕仍然明顯，而轉(zhuǎn)入siRNA-NC組劃痕寬度明顯減小(P<0.05)?？寺嶒灲Y(jié)果顯示(圖2D)，與轉(zhuǎn)入siRNA-NC組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)入siRNA1-MARCH8組細(xì)胞形成克隆數(shù)明顯降低(P<0.05)。以上結(jié)果說明下調(diào)MARCH8表達(dá)后，細(xì)胞侵襲、遷移、增殖和克隆形成能力均明顯降低。

圖1 siRNA-MARCH8轉(zhuǎn)染后MARCH8 在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)情況Fig.1 Expression of MARCH8 at mRNA level and at protein level after transfection of MARCH8Note:A.The expression of MARCH8 at mRNA level in cervical cancer Siha cells,*.P<0.05,vs siRNA-NC group；B.The expression of MARCH8 at protein level in Siha cells.

2.3下調(diào)MARCH8表達(dá)對宮頸癌Siha細(xì)胞中侵襲標(biāo)記蛋白和增殖標(biāo)記蛋白的影響 采用蛋白質(zhì)印跡法探索下調(diào)MARCH8表達(dá)后對宮頸癌Siha細(xì)胞中侵襲標(biāo)記蛋白MMP9、Vimentin和增殖標(biāo)記蛋白PCNA的影響。結(jié)果顯示(圖3)，轉(zhuǎn)入siRNA1-MARCH8組的細(xì)胞與轉(zhuǎn)入siRNA-NC組細(xì)胞相比，MMP9蛋白、Vimentin蛋白和PCNA蛋白的表達(dá)均明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 下調(diào)MARCH8表達(dá)后對宮頸癌Siha細(xì)胞侵襲，增殖、 遷移以及細(xì)胞克隆能力的影響Fig.2 Effect of down-regulation of MARCH8 on invasion，proliferation，migration and cell forming clone ability in cervical cancer Siha cellsNote:A.Transwell assay was used to detect the invasion of Siha cells；B.Scratch assay was used to detect the migration of Siha cells；C.CCK8 assay was used to detect the proliferation of Siha cells；D.Cell clone assay was used to detect the cell forming clone ability of Siha cells.*.P<0.05,vs siRNA-NC group.

圖3 下調(diào)MARCH8表達(dá)后對宮頸癌Siha細(xì)胞中MMP9蛋白、Vimentin蛋白和PCNA蛋白的影響Fig.3 Effect of down-regulation of MARCH8 on expression of MMP9，Vimentin and PCNA in cervical cancer Siha cellsNote:Expression of MMP9,Vimentin and PCNA was detected by Western blot.

圖4 下調(diào)MARCH8表達(dá)對宮頸癌Siha細(xì)胞中β-catenin和E-cadherin蛋白表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of down-regulation of MARCH8 on expression of β-catenin and E-cadherin in cervical cancer Siha cellsNote:Expression of β-catenin and E-cadherin was detected by Western blot.

2.4下調(diào)MARCH8表達(dá)對宮頸癌Siha細(xì)胞中β-catenin蛋白與E-cadherin蛋白表達(dá)的影響 蛋白質(zhì)印跡法實驗結(jié)果顯示(圖4)，轉(zhuǎn)入siRNA1-MARCH8組的細(xì)胞與轉(zhuǎn)入siRNA-NC組細(xì)胞相比，β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯降低，而E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。

3 討論

宮頸癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤之一，近年來由于宮頸癌篩查技術(shù)的推廣，大多數(shù)患有早期腫瘤的婦女可以被早診斷早治療，使宮頸癌的發(fā)病率和死亡率均有所下降。但隨著高危型人乳頭狀病毒感染的增加，使得目前宮頸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)年輕化[10,11]。因此，從分子水平上探討宮頸癌的發(fā)生發(fā)展機制對宮頸癌的診斷和治療都有非常重要的意義。

近年來，腫瘤免疫治療因其顯著的療效和創(chuàng)新性備受關(guān)注，是腫瘤治療中最具前景的測定研究方向之一[12,13]。其中眾多免疫相關(guān)分子都發(fā)現(xiàn)對腫瘤的侵襲，遷移有著重要影響，如MMP-9[14]，BANCR[15]。MARCH8基因在人體免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要作用，據(jù)研究，過度表達(dá)MARCH8將導(dǎo)致一些細(xì)胞黏附分子和抗原遞呈分子的表達(dá)下調(diào)，這其中包括CD44、CD88、MHCⅡ和CD166等[7,16]。因此，猜測MARCH8基因在腫瘤侵襲、遷移方面也可能發(fā)揮一定的作用。

據(jù)研究表明，MARCH8基因與生物發(fā)生發(fā)展過程具有密切聯(lián)系，其基因表達(dá)的下調(diào)或者過表達(dá)都可導(dǎo)致異常發(fā)育[17]。MARCH1，與MARCH8同屬于膜相關(guān)環(huán)指結(jié)構(gòu)域家族的一員，已被證明其基因的表達(dá)與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有一定的關(guān)系[18]，且有研究發(fā)現(xiàn)，MARCH8在食管癌中低表達(dá)，沉默MARCH8后，食管癌細(xì)胞的侵襲、遷移以及增殖能力都被抑制[19]，但MARCH8在宮頸癌中的作用還未有文獻(xiàn)報道。因此，為了探討MARCH8對宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響，本研究首先通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方式將特異性靶向MARCH8基因的siRNA-MARCH8和陰性對照組siRNA-NC轉(zhuǎn)染至宮頸癌Siha細(xì)胞中，并利用Real-time PCR和蛋白質(zhì)印跡法證實轉(zhuǎn)染成功。隨后，采用Transwell小室法，劃痕愈合實驗，CCK-8實驗以及細(xì)胞平板克隆實驗分別檢測下調(diào)MARCH8表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞侵襲、遷移和增殖能力的影響。MMP9、Vimentin和PCNA蛋白與腫瘤的侵襲增殖密切相關(guān)，據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，MMP9、Vimentin和PCNA蛋白的表達(dá)下調(diào)能夠分別抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和增殖能力[20-22]，因此，我們再通過蛋白質(zhì)印跡法檢測下調(diào)MARCH8表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞Siha中侵襲標(biāo)記蛋白MMP9蛋白和Vimentin蛋白的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)MARCH8表達(dá)后，宮頸癌Siha細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖和克隆形成能力均明顯降低，MMP9、Vimentin和PCNA蛋白的表達(dá)也明顯下降，這一結(jié)果跟侵襲增殖能力下降是相一致的。由此可見，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中，MARCH8基因可能起著促進(jìn)腫瘤形成和發(fā)育的作用。

Wnt/β-catenin信號通路在生物發(fā)育、細(xì)胞轉(zhuǎn)運以及細(xì)胞凋亡等生命過程中發(fā)揮著巨大作用,其異?；罨c多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路中的關(guān)鍵分子，其在細(xì)胞質(zhì)中累積到一定程度后，移位到細(xì)胞核中進(jìn)而激活胞核中的下游信號分子。β-catenin能通過E-cadherin蛋白連接到細(xì)胞骨架的肌動蛋白上，并且E-cadherin蛋白的缺失會增加腫瘤的發(fā)生，對腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移也有影響[23，24]。因此，為了研究MARCH8促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是否與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)，本研究在成功下調(diào)MARCH8基因表達(dá)后，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測β-catenin和E-cadherin蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明，β-catenin表達(dá)水平在下調(diào)MARCH8基因表達(dá)后明顯降低，而E-cadherin表達(dá)水平則明顯升高。因此，可以推測，下調(diào)MARCH8基因后導(dǎo)致的β-catenin蛋白表達(dá)水平降低可能是通過E-cadherin蛋白表達(dá)水平的升高來實現(xiàn)的，進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin通路后，對宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為發(fā)揮抑制的作用。

綜上所述，MARCH8在宮頸癌中發(fā)揮著促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重大作用，且這一過程可能與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。