蔣潤枝， 馬翠亭， 馮先楚， 楊蒙立， 程立寶

(揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇揚州 225009)

蓮藕(NelumbonuciferaGaertn)是睡蓮科(Nymphaeaceae)蓮屬多年生水生草本植物，在我國有3 000多年的栽培歷史[1]，是我國主要水生蔬菜之一，以膨大根狀莖(俗稱藕)供食用，其營養(yǎng)豐富，深受群眾喜愛，是我國主要出口創(chuàng)匯型蔬菜之一[2]。蓮藕根系不發(fā)達，不定根的形成直接影響蓮藕植株的后期發(fā)育。因有性繁殖的實生苗幼苗期較長，發(fā)育遲緩，影響植株后期的生長發(fā)育，所以目前生產(chǎn)上通常采用無性繁殖的繁殖方法。通過雜交產(chǎn)生變異，再通過無性繁殖固定變異是蓮藕新品種創(chuàng)制的主要途徑，也是蓮藕新品種培育的主要手段，但通過有性雜交獲得的蓮藕實生苗不定根發(fā)生量較少，導致苗期較長、植株當年不能開花，進而影響形成生產(chǎn)用種藕或商品藕。因此，發(fā)掘蓮藕實生苗不定根形成過程激素調(diào)控機制，是加速蓮藕新品種選育、縮短育種年限的有效途徑，也為加速蓮藕種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育奠定重要基礎。

吲哚乙酸(IAA)作為生長素中最重要的一種內(nèi)源激素，參與植物發(fā)育的諸多過程，調(diào)控多種生理反應。研究表明一定濃度的IAA可以顯著促進作物根系的生長發(fā)育[3-5]。過氧化物酶(POD)是IAA分解代謝的關鍵酶，在IAA分解代謝過程中起著關鍵作用，許多研究發(fā)現(xiàn)POD參與IAA的分解，植物的POD通過催化IAA氧化脫羧來調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的生長素水平，從而保持植物的正常生長發(fā)育[6]。乙烯能夠促進果實成熟并具有對幼苗生長的“三重反應”(抑制莖的伸長生長、促進莖或根的增粗與促進莖的橫向生長)，此外它還具有誘導不定根和根毛的發(fā)生、促進葉片衰老、打破種子和芽的休眠及促進器官脫落等功能。目前，相關研究表明乙烯在不定根形成方面的影響主要有促進[7-9]、抑制[10]和不作用[11]3種觀點。葉片剪除處理對植物的生長發(fā)育起到一定的促進作用。梁嫻等研究了在不同剪除方式下，草坪黑麥草根系活性的變化，適當?shù)募舫螖?shù)和修剪高度能夠促進草坪黑麥草根系活性的升高，說明剪除處理能夠促進地下根系的生長[12]。陳龔的研究表明，在一定程度上提高剪葉程度和次數(shù)，可明顯提高煙苗根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量、總根長、根表面積及二級側根數(shù)[13]。

目前有關蓮藕實生苗不定根生長發(fā)育的研究較少，乙烯、生長素和葉片剪除方式對實生苗形成和POD活性的影響尚無報道，本試驗研究了乙烯利、生長素和葉片剪除處理之后的蓮藕實生苗不定根形成和對POD活性的影響，為深入解析蓮藕不定根形成的激素調(diào)控機理及種質(zhì)改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

1.1.1 乙烯和生長素對蓮藕實生苗不定根形成的影響 試驗材料為江西太空蓮，在揚州大學園藝與植物保護學院的RXZ-300D智能人工氣候箱中培養(yǎng)，白天溫度30 ℃，夜間溫度24 ℃，濕度70%；該試驗于2015年7月至2017年10月開展。待蓮籽(已破殼)充分吸水發(fā)芽后，即2張子葉之間有裂縫時，選取長勢一致的實生苗放置于塑料盒(長22 cm×寬 15 cm×高16 cm)中。利用不同濃度的IAA、TIBA、乙烯利和1-MCP(表1)處理蓮藕實生苗3 d后置于清水中培養(yǎng)，每2 d更換1次清水。每個處理3個重復，每個重復50株。

表1 不同溶液處理濃度

1.1.2 葉片剪除處理對蓮藕實生苗不定根形成的影響 將已破殼的江西太空蓮蓮籽放在玻璃瓶(上口直徑5.5 cm，下口直徑6.5 cm，高7 cm)中培養(yǎng)，待蓮籽實生苗長至5～7 cm時，對實生苗進行剪除處理。此處理包括水面以上葉片剪除和水面以下葉片剪除2個處理(圖1)。水面以上剪除處理：用剪刀將實生苗的葉片和部分葉柄剪去，剪留葉柄長度高于水面2 cm左右。水面以下剪除處理：在實生苗葉柄的3～4 cm 處用剪刀將上部葉片和葉柄剪除，并將剪口處用塑料薄膜封住，以防止水灌入葉柄。在2次剪除處理后(早、晚各1次)進行第1次取樣，待水面以上剪除處理的蓮藕實生苗長出不定根后進行第2次取樣。

1.1.3 不定根數(shù)量的測定 待蓮藕實生苗長出不定根之后，統(tǒng)計根長≥0.5 mm的所有不定根數(shù)量，計算生根率：

生根率=生根種子個數(shù)/總個數(shù)×100%。

1.2 試驗儀器與試劑

本試驗中所用到儀器包括酶標儀、離心機；本試驗中所用到的主要試劑包括過氧化物酶(peroxidase，POD)試劑盒(購自蘇州科銘生物技術有限公司)。

1.3 POD活性測定

使用過氧化物酶試劑盒測定樣品中過氧化物酶的活性。按照組織質(zhì)量(g) ∶提取液體積(mL)為1 g ∶10 mL的比例，稱取0.1 g混樣，加入1 mL提取液，進行冰浴勻漿，10 000g4 ℃離心10 min，去上清，置冰上待測。測定步驟如下：

在微量石英比色皿或96孔板中按順序加入上述試劑，立即混勻并計時，記錄470 nm下30 s時的吸光值D1和1 min 30 s后的吸光值D2。

(1)分光光度計或酶標儀預熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至470 nm，蒸餾水調(diào)零。

(2)測定前將試劑一、二和三室溫放置10 min以上，然后進行如下操作(表2)。

表2 樣品測定

(3)POD活性的計算。

單位定義：1 g組織在1 mL反應體系中1 minD470 nm變化0.01為1個酶活性單位。

POD(U/g)=ΔD×V反總÷(m×V樣÷V樣總)÷0.01÷t=2 500×ΔD÷m。

式中：V反總表示反應體系總體積，mL；V樣表示加入樣本體積，mL；V樣總表示加入提取液體積，mL；t表示反應時間，min；m表示樣本質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS 16.0軟件中One-Way ANOVA分析Duncan’s法(P<0.05)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 IAA對蓮藕實生苗不定根形成的影響

2.1.1 不同濃度IAA處理對蓮藕實生苗不定根數(shù)量的影響 不同濃度的生長素對蓮藕實生苗不定根形成的效果不同。從圖2中可以看出，蓮藕實生苗經(jīng)低濃度的IAA處理后，能顯著促進不定根數(shù)量的增加，其中15 μmol/L IAA處理效果好于75、125、175 μmol/L IAA 處理。利用15、75 μmol/L IAA處理后，在調(diào)查時間內(nèi)實生苗不定根形成數(shù)量始終顯著高于對照，而125 μmol/L IAA處理在后期促進效果不明顯，后期甚至出現(xiàn)顯著下降趨勢；利用175 μmol/L IAA處理實生苗后1～6 d發(fā)現(xiàn)，不定根形成的數(shù)量極顯著低于對照。以上試驗結果表明，低濃度的生長素促進蓮藕實生苗不定根的形成，而高濃度的生長素則抑制不定根的發(fā)生。

2.1.2 不同濃度IAA處理對蓮藕實生苗不定根生根率的影響 表3為不同濃度IAA處理后蓮藕實生苗在6 d內(nèi)生根率的變化，從表3可看出，不同濃度IAA處理后的實生苗與對照組相比，15 μmol/L IAA效果最好，在5 d時生根率已達100%，生根率顯著高于對照。75、125 μmol/L IAA在 1～3 d有顯著促進作用，在4、5 d時，75 μmol/L IAA處理較對照相比效果不明顯。125 μmol/L IAA在4 d時，較對照相比差異不顯著，而在5、6 d時，呈顯著負增加的趨勢。175 μmol/L IAAIAA處理后顯著抑制了實生苗的不定根生根率。

表3 不同濃度IAA處理后蓮藕實生苗生根率的變化

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異達到0.05顯著水平，相同小寫字母表示在0.05水平上差異不顯著。下同。

2.2 TIBA對蓮藕實生苗不定根形成的影響

2.2.1 不同濃度TIBA處理對蓮藕實生苗不定根數(shù)量的影響 與IAA處理效果相反，不同濃度TIBA處理蓮藕實生苗后均對不定根數(shù)量產(chǎn)生抑制作用，抑制效果15 μmol/L好于10、5 μmol/L(圖3)。5、10 μmol/L TIBA處理后，蓮藕實生苗在1～4 d(2 d除外)不定根數(shù)量較對照相比顯著減少，6 d時，抑制效果達到極顯著水平。15 μmol/L TIBA在調(diào)查期內(nèi)始終極顯著地抑制了藕實生苗不定根的形成。

2.2.2 不同濃度TIBA處理對蓮藕實生苗不定根生根率的影響 從表4可看出，經(jīng)TIBA處理后，蓮藕實生苗的生根率與對照組相比呈顯著下降的趨勢。利用5、10、15 μmol/L TIBA處理后，生根率在1～6 d都顯著降低，隨濃度的增加抑制效果越明顯，當對照生根率達100%時，5、10、15 μmol/L 處理的生根率僅達86%、79%、61%(第5 d)。

表4 不同濃度TIBA處理后蓮藕實生苗生根率的變化

2.3 乙烯利對蓮藕實生苗不定根形成的影響

2.3.1 不同濃度乙烯利處理對蓮藕實生苗不定根數(shù)量的影響 利用不同濃度(100、200、300 mg/L)的乙烯利處理蓮藕實生苗，結果如圖4所示。100 mg/L乙烯利處理后，與對照相比，不定根形成數(shù)量在1～3 d差異不顯著，4～6 d時，促進效果達到顯著水平；200、300 mg/L乙烯利處理在1～3 d時顯著促進不定根的形成，4～6 d時，促進效果達到極顯著水平。以上結果表明，一定濃度的乙烯利能夠促進蓮藕實生苗不定根數(shù)量的增加。

2.3.2 不同濃度乙烯利處理對蓮藕實生苗不定根生根率的影響 由表5可知，與對照相比，一定濃度的乙烯利能夠提高蓮藕實生苗不定根的生根率。在整個調(diào)查期間，其中 200 mg/L 乙烯利對生根率的促進效果最佳，6 d時蓮藕實生苗生根率已達100%，與100 mg/L乙烯利之間差異顯著，與300 mg/L乙烯利之間差異不顯著。

表5 不同濃度乙烯利處理后蓮藕實生苗生根率的變化

2.4 1-MCP對蓮藕實生苗不定根形成的影響

2.4.1 不同濃度1-MCP處理對蓮藕實生苗不定根數(shù)量的影響 利用100、200、300 mg/L 1-MCP處理蓮藕實生苗，研究其對蓮藕實生苗不定根形成的影響。結果表明，100、200、300 mg/L 1-MCP在調(diào)查時間內(nèi)，均能顯著抑制不定根的生成，且200、300 mg/L 1-MCP的抑制效果好于100 mg/L(圖5)，說明降低植物體中內(nèi)源乙烯含量能抑制不定根的形成。

2.4.2 不同濃度1-MCP處理對蓮藕實生苗不定根生根率的影響 由表6可知，1-MCP處理后蓮藕實生苗的生根率在調(diào)查時間內(nèi)顯著降低。當對照的生根率達100%時(5 d)，1-MCP處理過的實生苗生根率分別為85%、67%和70%。從作用效果來講，200、300 mg/L抑制作用好于 100 mg/L，200 mg/L 和300 mg/L之間無顯著差異。

2.5 葉片剪除處理對蓮藕實生苗不定根的影響

2.5.1 葉片剪除處理對蓮藕實生苗不定根數(shù)量的影響 水面以上葉片剪除處理和水面以下葉片剪除處理對影響蓮藕實生苗不定根形成的效果不同。圖6表明，與對照相比，水面以上葉片剪除處理顯著促進了實生苗不定根的形成，葉片水面以下剪除反而抑制了實生苗不定根的形成。

表6 不同濃度1-MCP處理后蓮藕實生苗生根率的變化

2.5.2 葉片剪除處理對蓮藕實生苗不定根生根率的影響 由表7可知，葉片水面以上剪除處理顯著高于對照和葉片水面以下剪除處理。葉片剪除處理4 d，水面以上剪除處理生根率達100%，對照生根率為38.4%，而水面以下處理只有0，說明不同的葉片剪除方式對不定根的形成具有很大的影響(表6)。

表7 葉片剪除處理對蓮藕實生苗的生根率的影響

2.6 不同處理對蓮藕實生苗POD活性的影響

從圖7可知，經(jīng)過IAA和ETH處理的植株在24 h內(nèi)POD活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(圖7-A、圖7-C)，而TIBA、1-MCP和對照組植株POD活性一直保持升高趨勢(圖7-B、圖7-D)。其中12 h時，1-MCP、IAA、TIBA、乙烯利處理的POD活力無明顯差異，但顯著高于對照，而在24 h時，POD活性大小依次為TIBA>1-MCP、對照>乙烯利>IAA處理，說明乙烯利和IAA均能改變植株體內(nèi)POD活性。

從圖7-E可知，對照POD活性呈現(xiàn)先下降后上升最后下降的趨勢，而葉片水面以下剪除POD活性一直高于葉片水面以上剪除POD活性。從圖7-F可知，在蓮藕實生苗長出不定根后，對照POD活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢；葉片水面以上剪除POD活性呈現(xiàn)出顯著高于葉片水面以下剪除POD活性而后低于葉片水面以下剪除POD活性的趨勢。

3 結論

本研究發(fā)現(xiàn)，15 μmol/L IAA能夠顯著提高蓮藕實生苗不定根數(shù)量和生根率，而175 μmol/L IAA處理后顯著抑制了實生苗的不定根的數(shù)量和生根率，這表明低濃度的生長素對不定根起到促進作用，而高濃度的生長素則抑制不定根的發(fā)生。一定濃度的乙烯利能夠促進蓮藕實生苗不定根數(shù)量和生根率的增加，200、300 mg/L乙烯利效果最佳。植株葉片剪除處理對不定根有一定影響，與對照相比，水面以上剪除可以顯著促進蓮藕實生苗不定根的生長發(fā)育，水面以下剪除起到一定的抑制作用。由以上結論推測，POD可能通過影響生長素含量來影響植株的生長發(fā)育。

4 討論

裴東等研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入一定水平的IBA能夠誘導核桃子葉產(chǎn)生不定根[14]。江玲等發(fā)現(xiàn)，利用適宜濃度的吲哚乙酸處理萵苣幼苗的根部20～30 h，可促進大量側根原基啟動和突起[15]。王金祥研究表明，利用100 μmol/L乙烯利處理大豆插條，對其不定根的形成有一定促進作用[16]；而孫逸超研究表明，5 μL/L 1-MCP可顯著抑制綠豆下胚軸不定根的發(fā)生[17]。以上報道與本試驗結果相似，本研究發(fā)現(xiàn) 10 μmol/L IAA能夠顯著促進蓮藕實生苗不定根的形成。另外一定濃度的乙烯利也能夠促進蓮藕實生苗不定根的形成，這與謝陽姣等的試驗結果[7]相似。劉國順等在烤煙漂浮育苗中發(fā)現(xiàn)，通過剪葉處理可以顯著提高根系活性，暗示剪葉處理較未剪葉的對照相比，能明顯地促進根系的生長發(fā)育[18]，這與呂芳等的研究結論[19]相一致。本試驗對蓮藕實生苗進行剪葉處理后，能顯著增加實生苗不定根數(shù)目和提高生根率，說明剪葉處理對蓮藕實生苗不定根的形成有顯著促進作用。但凌啟鴻等的研究表明，在越冬前對小麥進行剪葉處理，不僅明顯減少了分蘗穗數(shù)和每株穗數(shù)，且對次生根數(shù)有一定的抑制作用[20]，說明不同物種的葉面剪除效果可能不同。

外源刺激可導致植物體內(nèi)POD活性發(fā)生變化，這與物種種類、生長習性等有關。廖祥儒等研究發(fā)現(xiàn)，用甘露醇和 6-BA 處理水稻后，明顯降低了POD的活性[21]。在小麥干旱脅迫研究試驗中，陳軍等研究發(fā)現(xiàn)小麥萌發(fā)期在0～120 h期間，5%、15% PEG-6000脅迫下小麥POD活性呈逐漸上升趨勢，但15% PEG-6000脅迫下小麥POD活性比5% PEG-6000脅迫下其活性增幅大，25%、35% PEG-6000脅迫下小麥POD活性表現(xiàn)為先上升后下降[22]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下，荔枝葉片細胞胞質(zhì)以及與壁以離子鍵和與壁以共價鍵結合的POD和IAA氧化酶(比)活性均上升，IAA氧化酶和POD(比)活性的增加，引起IAA含量下降[23]。本試驗利用乙烯利、生長素處理蓮藕實生苗，發(fā)現(xiàn)在24 h內(nèi)POD活性呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，而葉片水面以上剪除也得到相似的結果，說明POD活性可能與不定根的形成相關，但這種相關性是否和實生苗內(nèi)源IAA含量有關還有待進一步驗證。