劉 荷，吳慶華，史惠蓉，孔祥東，趙振華

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心 鄭州 450052

46,XY單純型生殖腺發(fā)育不全(46,XY pure gonadal dysgenesis；46,XY PGD)于1955年由Swyer首次報(bào)道，也稱Swyer綜合征，是一種罕見的46,XY性發(fā)育異常疾病，可能由于胚胎期性別決定階段基因調(diào)控異常導(dǎo)致。女性表型的患者攜帶46,XY核型，有女性外生殖器、正常或始基子宮、條索狀性腺、多伴第二性征發(fā)育不良和原發(fā)性閉經(jīng)。46,XY PGD患者的治療重在及早切除未分化性腺和激素替代治療。然而，在臨床實(shí)踐中，由于包括46,XY PGD 等的46,XY性發(fā)育異?；颊叩呐R床異質(zhì)性和遺傳異質(zhì)性高，以及對該類疾病宣教較少，患者依從性差，臨床診治中易發(fā)生漏診或失訪。本研究對8例46,XY PGD患者的臨床表型和診治資料進(jìn)行分析，并對在該病中起重要作用的性別決定基因(sex determining gene Y,SRY)進(jìn)行測序分析，以進(jìn)一步探討46,XY PGD患者的臨床診治策略及遺傳學(xué)病因。

1 對象與方法

1.1研究對象8例46,XY PGD病例均為2013年8月至2017年7月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的患者，其父母均非近親婚配，否認(rèn)家中有類似病史及遺傳病史，患者母親孕期無特殊用藥史。對患者臨床表現(xiàn)、體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)檢查、手術(shù)及隨訪情況進(jìn)行回顧性分析研究。所有患者外周血均在本實(shí)驗(yàn)室保存并行SRY基因突變檢測。

1.2身高檢測和Tanner分期除1例2歲患兒未測身高，余患者均測量身高。Tanner分期[1]評價(jià)第二性征發(fā)育情況。

1.3影像學(xué)檢查盆腔彩色多普勒超聲是主要檢查手段，以了解子宮及性腺發(fā)育情況、有無性腺腫瘤。

1.4G顯帶核型分析取0.5 mL肝素鋰抗凝的外周血接種于5 mL PRMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)72 h，加入20 mg/L秋水仙素200 μL，3 h后常規(guī)染色體制片，G顯帶核型分析，每例計(jì)數(shù)30～100個(gè)細(xì)胞。

1.5SRY基因PCR及測序分析提取外周血基因組DNA，PCR擴(kuò)增位于Y染色體短臂上SRY基因的整個(gè)開放閱讀框架部分，運(yùn)用Primer 5.0設(shè)計(jì)包含SRY基因外顯子及其部分側(cè)翼的擴(kuò)增引物，引物1上游序列5’-AAGTTTCGAACTCTGGCACCTTTCA-3’，下游序列5’-GGCCTGTAATTTCTGTGCCTCCTGG-3’；引物2上游序列5’-GTCTCGCGATCAGAGGCGCA-3’，下游序列5’-GGAGCATCTAGGTAGGTCTTTGTAGCC-3’。PCR反應(yīng)體系為25 μL：10 μmol/L上下游引物各1 μL，DNA樣本50 ng。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，57～63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物純化后，用ABI3130X基因測序儀進(jìn)行雙向測序，測序結(jié)果用Chromas軟件與正常序列進(jìn)行對比，尋找基因突變位點(diǎn)。

1.6血清性激素水平測定所有患者性激素水平均使用羅氏電化學(xué)自動(dòng)發(fā)光儀進(jìn)行檢測，各項(xiàng)正常范圍如下：卵泡刺激素(FSH，卵泡期3.5～12.5 IU/L)、黃體生成素(LH，卵泡期2.4～12.6 IU/L)、雌二醇(E2，卵泡期12.4～233.0 ng/L)、孕激素(P，卵泡期0.2～1.5 μg/L)及睪酮(T，女性0.084～0.481 μg/L)等。

1.7病理檢查3名患者明確診斷后，即行性腺切除手術(shù)并送行病理學(xué)檢查。

1.8隨訪要求幼兒患者每年復(fù)查，青春期后的患者每隔3個(gè)月來院復(fù)查。

2 結(jié)果

2.1 8例患者的臨床資料及輔助檢查結(jié)果見表1。所有患者選擇撫養(yǎng)的社會(huì)性別均為女性，原發(fā)性閉經(jīng)6例，生長發(fā)育遲緩3例，外陰發(fā)育異常1例。測量身高的7例患者中有3例身高低于正常同齡人，所有患者乳房及陰毛發(fā)育情況普遍落后于正常同齡人。

2.2盆腔超聲檢查子宮及性腺發(fā)育情況2例患者未見子宮，6例患者子宮體積?。?名患者盆腔未探及附件。除1例2歲的兒童未查性激素外，余患者均行性激素水平檢測，F(xiàn)SH為(52.8±35.3)IU/L，LH為(17.6±14.0)IU/L，E2水平偏低，為(19.4±25.0)ng/L(<10 ng/L按5 ng/L計(jì)算，<5 ng/L按2.5 ng/L計(jì)算)，P為(0.5±0.3)μg/L，T為(0.2±0.1)μg/L。

2.3患者SRY基因檢測結(jié)果、病理學(xué)結(jié)果及超聲復(fù)查結(jié)果所有患者外周血染色體核型分析提示46,XY，SRY基因擴(kuò)增均為陽性；DNA測序提示病例4攜帶SRY基因c.280C→G(p.Leu94Val)突變。對該患者父親及妹妹進(jìn)行SRY基因檢測，其父親攜帶SRY基因，但未檢測到突變位點(diǎn)(圖1)，其妹未檢出SRY基因，提示該家族患者為新發(fā)突變。其他7例患者SRY基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序未見異常。

表1 8例患者初診的臨床資料及輔助檢查結(jié)果

*：B表示乳房；P表示陰毛；均分1～5級(jí)

上排：病例4患者的SRY基因檢測結(jié)果，箭頭處可見患者存在SRY基因c.280C→G(p.Leu94Val)突變；下排：患者父親未見該位點(diǎn)突變

圖1SRY基因檢測結(jié)果

所有患者一經(jīng)診斷，均告知其發(fā)生性腺腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)及建議腹腔鏡探查并行性腺切除術(shù)，有3例患者行手術(shù)。病例2性腺切除后病理檢查見左、右附件輸卵管組織，另見少許卵巢樣組織；病例6病理檢查提示左側(cè)性腺見輸卵管樣結(jié)構(gòu)及纖維組織，右側(cè)性腺見輸卵管樣及卵巢樣組織；病例8雙側(cè)附件切除組織病理示為輸卵管樣組織，未見性腺組織。其余5名患者因超聲未發(fā)現(xiàn)性腺，要求暫緩行性腺探查切除術(shù)。

患者就診后給予戊酸雌二醇2 mg口服，3例患者子宮發(fā)育有明顯改善。病例5于17歲初次就診時(shí)子宮大小為33 mm×24 mm×12 mm，性腺切除術(shù)后10個(gè)月后復(fù)查子宮大小為49 mm×26 mm×24 mm，治療22月后復(fù)查子宮大小為43 mm×34 mm×30 mm。病例6初次就診時(shí)子宮大小為20 mm×10 mm×17 mm，口服戊酸雌二醇兩月后復(fù)查超聲，結(jié)果提示子宮大小為34 mm×33 mm×21 mm。病例7初次就診時(shí)子宮大小為27 mm×21 mm×12 mm，7個(gè)月后復(fù)查顯示子宮大小為31 mm×24 mm×10 mm。而攜帶有SRY基因突變的病例4行6個(gè)月的雌激素補(bǔ)充治療，子宮大小無明顯改變，患者及家屬放棄治療。病例3為9歲患兒，應(yīng)用生長激素治療，暫未行性激素治療。病例1和2未按要求復(fù)查并失訪。

3 討論

本研究對8例46,XY PGD患者的臨床表現(xiàn)和診治進(jìn)行了總結(jié)分析，對最常見的遺傳相關(guān)基因SRY進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)其中1例患者攜帶SRY基因c.280C→G(p.Leu94Val)突變。

46,XY PGD的發(fā)生率低，其診斷基于全面臨床評價(jià)、詳細(xì)的病史，特征性改變以及相關(guān)檢查(包括染色體核型、性激素測定)等。在臨床實(shí)踐中，要與多種其他類型的46,XY性發(fā)育異常疾病相鑒別。攜帶45,X/46,XY嵌合體核型的特納綜合征患者的臨床表型常與46，XY PGD相似，患者因有發(fā)育不良的性腺導(dǎo)致了子宮發(fā)育不良、第二性征發(fā)育落后和原發(fā)性閉經(jīng)等，查外周血染色體有Y染色體存在，兩類疾病的主要鑒別在于45,X/46,XY核型的患者多有身材矮小，而46,XY PGD患者可能由于Y染色體的作用或缺乏雌激素致骨骺閉合延遲，故絕大多數(shù)患者身高正?；蚋哂谄骄陨砀遊2-4]。然而，在本研究中有兩例患者主要就診原因?yàn)樯砀甙?，最初診斷考慮其為45,X/46,XY嵌合型特納綜合征，經(jīng)行染色體檢查，核型計(jì)數(shù)100個(gè)后確定為46,XY核型，臨床診斷考慮46,XY PGD，故對于疑似性染色體異常導(dǎo)致的性腺發(fā)育不良患者，應(yīng)對染色體核型計(jì)數(shù)至100個(gè)。46,XY PGD要與雄激素不敏感綜合征相鑒別，后者臨床變異廣泛，包括從正常女性表型到外生殖器發(fā)育不良的男性，存在男性性腺、有較高的雄激素水平是雄激素不敏感綜合征區(qū)別于46,XY PGD患者的主要特征。所有攜帶46,XY核型的17α羥化酶缺陷癥患者的表型均為女性，身高正?；蚋哂谄骄运?，可有發(fā)育不良的性腺、第二性征發(fā)育不良及原發(fā)閉經(jīng)等，臨床表現(xiàn)與46,XY PGD相似，17α羥化酶缺陷癥患者血孕酮及血尿17羥孕酮增高、腎上腺皮質(zhì)增生和高血壓是與46,XY PGD鑒別的要點(diǎn)[5]。此外，46,XY PGD要和46,XX PGD相鑒別，故對于性發(fā)育不良患者，核型分析是最基本和重要的實(shí)驗(yàn)室檢查。

部分46,XY性發(fā)育異常疾病如雄激素不敏感綜合征和17α羥化酶缺陷癥的致病基因已經(jīng)明確，而對46,XY PGD的致病原因還不甚清楚。目前研究最明確的是SRY基因在性別決定中的作用，10%～15%的46,XY 性腺發(fā)育不良患者攜帶SRY基因突變[6]。本研究中的8例46,XY單純型生殖腺發(fā)育不全患者行SRY基因PCR和測序，其中病例4攜帶一個(gè)新發(fā)的SRY基因c.280C→G(p.Leu94Val)突變，導(dǎo)致原來編碼亮氨酸(Leu)的第94位密碼子被纈氨酸(Val)代替，該突變型在既往國內(nèi)外文獻(xiàn)未見報(bào)道。Mitchell等[7]對46，XY PGD患者中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)SRY基因的p.L94P突變行功能分析，提示第94位點(diǎn)處氨基酸的改變導(dǎo)致SRY基因HMG區(qū)第二個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)破壞，降低了DNA親和力。故本研究中病例4患者攜帶的SRY基因c.280C→G(p.Leu94Val)突變可能導(dǎo)致SRY基因與DNA結(jié)合能力消失，從而導(dǎo)致46,XY PGD的發(fā)生。其余7例患者SRY擴(kuò)增陽性而無突變，提示SRY基因雖是男性性別分化的啟動(dòng)基因，但并不是影響男性性別分化唯一的基因，影響性腺分化發(fā)育過程的其他基因如SOX9、NR5A1、WT1、NR0B1、WNT4等也可能參與46,XY單純型生殖腺發(fā)育不全的發(fā)生。

及早對46,XY PGD患者明確診斷對于患者治療和預(yù)后有三個(gè)重要意義：降低惡性腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、誘導(dǎo)青春期發(fā)育及預(yù)防骨質(zhì)疏松。46,XY PGD患者發(fā)生惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)在15%～35%，最常見的腫瘤是性腺母細(xì)胞瘤和無性細(xì)胞瘤，腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)隨年齡增長而增加，30歲時(shí)發(fā)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)為50%～70%，40歲時(shí)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)80%[8]，一旦診斷，立即進(jìn)行雙側(cè)性腺切除術(shù)。多數(shù)46,XY PGD患者性激素呈現(xiàn)高促性腺激素低性腺激素水平，如果46,XY女性患者仍有較正常的雌激素水平及乳腺發(fā)育，應(yīng)警惕激素分泌型腫瘤存在的可能性[9]，其分泌的激素主要為雌激素，引起假性女性第二性征發(fā)育。

對于46,XY PGD患者的處理和其他原因?qū)е碌穆殉补δ懿蝗粯?，包括?yīng)用雌激素進(jìn)行青春期誘導(dǎo)，以及長期的雌孕激素聯(lián)合應(yīng)用[10]。雌激素補(bǔ)充治療對于46,XY PGD女性患者的子宮發(fā)育有重要的作用。本研究中有2例患者因年齡較小，暫未給予激素補(bǔ)充治療，3例患者給予激素治療2月至22月，子宮均有明顯的發(fā)育；而攜帶SRY基因突變的患者行激素治療6個(gè)月后無明顯效果而放棄激素補(bǔ)充治療(盡管已告知激素治療對于心血管疾病或骨質(zhì)疏松疾病有重要的預(yù)防意義)。2例患者未遵醫(yī)囑定期復(fù)查。已有較多文獻(xiàn)[11-14]報(bào)道46,XY PGD患者在子宮發(fā)育至正常大小時(shí)，可以通過贈(zèng)卵試管嬰兒技術(shù)成功妊娠分娩。Y染色體的存在不影響輔助生育技術(shù)中藥物治療或妊娠期激素對子宮內(nèi)膜的效果。

從本研究和既往46,XY PGD相關(guān)文獻(xiàn)可見，及早診斷和治療對患者的預(yù)后尤為重要，作者在研究中發(fā)現(xiàn)，臨床診治中存在隨訪困難和患者依從性差等情況，與社會(huì)宣教和患者意識(shí)有關(guān)。在本病長期的診治中，遺傳咨詢特別重要，要明確告知患者性腺腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和性腺及早切除的必要性，與此同時(shí)，對于46,XY PGD患者的心理支持很重要，通過系統(tǒng)治療和長期監(jiān)測隨訪調(diào)整治療方案，患者也可以有生育機(jī)會(huì)并擁有正常的生活[15-16]。