劉 端，李紅雨，臧星卉，魚志琪，孫 瑋，李玉光

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052

卵巢癌是女性生殖器常見的三大惡性腫瘤之一，早期病變不易發(fā)現(xiàn)，晚期缺乏有效的治療手段，致死率位居?jì)D科惡性腫瘤之首[1]。目前主要采用以手術(shù)為主的綜合治療，包括放療和化療等，但5 a生存率僅為20%～25%[1]。隨著對卵巢癌發(fā)生發(fā)展分子生物學(xué)機(jī)制的研究，新的治療靶點(diǎn)不斷出現(xiàn)。其中，血管靶向治療是目前熱點(diǎn)之一，尤其是血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)單克隆抗體貝伐單抗[2]，其次與侵襲相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)家族也受到了極大的關(guān)注[3]。本文旨在了解卵巢癌組織中VEGF、MMP-9的表達(dá)情況以及貝伐單抗聯(lián)合順鉑對卵巢癌細(xì)胞的作用機(jī)制，為卵巢癌的臨床治療提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對象選擇2015年9月至2017年6月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科住院并經(jīng)病理檢查確診的101例患者。其中：上皮性卵巢惡性腫瘤患者41例(卵巢癌組)，年齡28～75歲，中位年齡47歲，術(shù)前未接受放化療；卵巢良性腫瘤患者30例(卵巢良性腫瘤組)，年齡20～72歲，中位年齡45歲；因良性子宮病變行卵巢切除的患者30例(對照組)，年齡50～70歲，中位年齡55歲。卵巢癌組、卵巢良性腫瘤組與對照組年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2主要試劑免疫組化試劑均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；貝伐單抗購于瑞士羅氏公司；順鉑購于齊魯制藥有限公司；兔抗人VEGF、MMP-9、AKT、Bad單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠/兔IgG抗體購于美國CST公司；Western blot化學(xué)發(fā)光液購于美國Millipore公司；BCA蛋白定量試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 3種卵巢組織中VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)的檢測采用免疫組化法檢測3種組織中VEGF、MMP-9蛋白的表達(dá)情況。將制備好的石蠟組織切片置于二甲苯中脫蠟，再經(jīng)乙醇梯度水化后，放于枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液中加熱，用體積分?jǐn)?shù)為3%過氧化氫孵育，滅活內(nèi)源性過氧化氫酶。然后滴加體積分?jǐn)?shù)為10%山羊血清封閉30 min，加入鼠源抗VEGF、MMP-9一抗過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育30 min。滴加DAB顯色液，顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，當(dāng)陽性部位出現(xiàn)特異性顯色而背景無著色時(shí)，終止顯色。然后用蘇木素進(jìn)行復(fù)染，鹽酸乙醇分化液分化，藍(lán)化液藍(lán)化，梯度無水乙醇逐級脫水，二甲苯透明，最后用中性樹膠封片，在400倍光學(xué)顯微鏡下選取5個(gè)視野拍照。免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下。按著色強(qiáng)度評分：無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；按陽性細(xì)胞百分比評分：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞<25%為1分，25%～為2分，50%～為3分，75%～為4分。結(jié)果取2項(xiàng)評分的乘積，0～1分為蛋白陰性表達(dá)，≥2分為蛋白陽性表達(dá)。

1.4細(xì)胞及培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3由第四軍醫(yī)大學(xué)病原生物學(xué)教研室趙亞教授惠贈。細(xì)胞在含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清(美國Gibco公司)、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素(碧云天公司)的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，用2.5 g/L胰蛋白酶-EDTA消化并傳代。

1.5細(xì)胞活性檢測取對數(shù)生長期的卵巢癌細(xì)胞SKOV3，用2.5 g/L胰蛋白酶-EDTA消化并計(jì)數(shù)，按照2 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2中培養(yǎng)24 h后，將2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L的貝伐單抗加入到96孔板中，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)置無藥物處理組及無細(xì)胞空白對照組，藥物作用48 h。每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)放于37 ℃恒溫箱中繼續(xù)孵育4 h。然后棄上清，每孔加入150 μL DMSO溶液,用酶標(biāo)儀檢測570 nm處的吸光度(A)值。存活率=(加藥組A值-空白對照組A值)/(無藥物處理組A值-空白對照組A值)×100%，并計(jì)算IC50。

1.6細(xì)胞凋亡率檢測采用Annexin V-FITC和PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測貝伐單抗單獨(dú)及聯(lián)合順鉑對SKOV3細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。將對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞以每孔3×105個(gè)細(xì)胞的密度接種至6孔板中，置于恒溫箱中孵育24 h之后分別加入相應(yīng)的藥物(貝伐單抗5 mg/L、順鉑3 mg/L、貝伐單抗5 mg/L+順鉑3 mg/L)，對照組加入等體積的PBS，48 h后收集細(xì)胞，用PBS洗滌2～3遍。根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書，每管加入500 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min。于冰浴中用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7MMP-9及VEGF信號通路中關(guān)鍵蛋白AKT和Bad蛋白表達(dá)的檢測采用Western blot法。貝伐單抗5 mg/L、順鉑3 mg/L單獨(dú)及聯(lián)合使用處理SKOV3細(xì)胞48 h，提取細(xì)胞中的總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒定量，取30 μg蛋白，配制體積分?jǐn)?shù)5%濃縮膠、體積分?jǐn)?shù)15%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。經(jīng)過封閉(體積分?jǐn)?shù)為5% BSA室溫封閉2 h)、與一抗孵育(11 000稀釋，4 ℃孵育過夜)、洗滌(TBST洗滌3次，每次10 min)、與二抗孵育(14 000稀釋，室溫孵育1 h)、洗滌(TBST洗滌3次，每次10 min)后，在膜上覆蓋適量化學(xué)發(fā)光顯色液并置于Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)中成像、拍照。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。3種卵巢組織中VEGF、MMP-9蛋白陽性表達(dá)率的比較采用χ2檢驗(yàn)；卵巢癌組織中VEGF、 MMP-9蛋白表達(dá)的關(guān)系采用Pearson相關(guān)進(jìn)行分析；貝伐單抗單獨(dú)及聯(lián)合順鉑使用時(shí)卵巢癌細(xì)胞SKOV3凋亡率的比較采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1不同類型卵巢組織中VEGF、MMP-9蛋白的表達(dá)與對照組、卵巢良性腫瘤組比較，卵巢癌組VEGF、MMP-9蛋白陽性表達(dá)率升高(圖1、表1)。卵巢癌組織中VEGF、MMP-9蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(表2)。

A:正常卵巢組織；B：卵巢良性腫瘤組織；C:卵巢癌組織；1：VEGF蛋白；2：MMP-9蛋白圖1 3種卵巢組織中VEGF、MMP-9蛋白的表達(dá)(SP,×400)

表1 3種卵巢組織中VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)的比較

*：與卵巢癌組相比，P<0.001

表2 卵巢癌組織中VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)相關(guān)性分析 例

χ2=6.034，P=0.014，rp=0.360

2.2貝伐單抗對卵巢癌細(xì)胞SKOV3的體外增殖抑制作用貝伐單抗對卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖抑制作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)，呈劑量依賴性(圖2)，IC50為(8.89±0.27) mg/L。

圖2 貝伐單抗對卵巢癌細(xì)胞SKOV3的體外增殖抑制作用

2.3 4組SKOV3細(xì)胞凋亡率的比較結(jié)果見表3。

表3 4組SKOV3細(xì)胞凋亡率的比較 %

F貝伐單抗=187.892，F(xiàn)順鉑=404.224，F(xiàn)交互=161.284，P均<0.001

2.4貝伐單抗聯(lián)合順鉑對MMP-9及VEGF信號通路中AKT、Bad蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖3。

1～4：分別為對照組、貝伐單抗組、順鉑組、貝伐單抗+順鉑組

圖3貝伐單抗聯(lián)合順鉑對VEGF、MMP-9、p-AKT、AKT、Bad蛋白表達(dá)的影響

3 討論

VEGF在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中促進(jìn)新生血管的生成[4]，為腫瘤提供必需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)[5-7]。MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，幫助腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，也可以支持腫瘤細(xì)胞外滲和轉(zhuǎn)移[8-9]，MMP-9與血管生成及腫瘤侵襲能力密切相關(guān)，這對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移起到非常重要的作用[10-12]。在本研究中作者發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中VEGF、MMP-9蛋白的陽性表達(dá)率比卵巢良性腫瘤組及對照組高，且二者呈正相關(guān)，提示二者可能成為卵巢癌治療的聯(lián)合作用靶點(diǎn)。

貝伐單抗是重組的人源化單克隆抗體，主要與VEGF-A結(jié)合，抑制VEGF與其受體的結(jié)合，從而抑制腫瘤血管的生成[13]。目前，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)貝伐單抗用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、晚期非小細(xì)胞肺癌的一線治療。除此之外,貝伐單抗在肝癌、胃癌、卵巢癌等惡性腫瘤的應(yīng)用也取得較好的臨床療效，尤其是和化療藥物聯(lián)合使用時(shí)[14-16]。研究[17-18]發(fā)現(xiàn)，貝伐單抗在單獨(dú)使用時(shí)隨著其濃度的遞增，U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞所分泌的MMPs逐漸增多，增強(qiáng)了細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在動物實(shí)驗(yàn)[17]中，相比貝伐單抗的短期治療，其長期治療使腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。在本研究中Western blot結(jié)果顯示，貝伐單抗單獨(dú)作用于SKOV3細(xì)胞時(shí)并未減弱與侵襲相關(guān)的MMP-9蛋白的表達(dá)，但也沒有表現(xiàn)出增強(qiáng)的趨勢，貝伐單抗長期作用于卵巢癌細(xì)胞之后，MMP-9蛋白的表達(dá)水平是否有增加，還有待進(jìn)一步的研究。另外，有學(xué)者[17]通過貝伐單抗和MMP抑制劑的聯(lián)合干預(yù)，成功降低了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。在本實(shí)驗(yàn)中作者采用貝伐單抗聯(lián)合順鉑對卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行處理，凋亡結(jié)果顯示，貝伐單抗的單獨(dú)使用并未引起細(xì)胞的明顯凋亡，順鉑單獨(dú)使用時(shí)引起細(xì)胞的凋亡率也僅有13 %左右，但是兩者聯(lián)合使用后細(xì)胞的凋亡率明顯增加，說明二者的聯(lián)合使用在誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡方面起到了良好的協(xié)同效應(yīng)。同時(shí)Western blot結(jié)果也證實(shí)，貝伐單抗和順鉑單獨(dú)處理組與對照組相比促凋亡蛋白Bad的表達(dá)增強(qiáng)，在聯(lián)合用藥組中Bad表達(dá)增強(qiáng)更明顯。接下來作者對VEGF下游信號通路中的關(guān)鍵蛋白AKT進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，貝伐單抗單獨(dú)作用于卵巢癌細(xì)胞時(shí)可減弱AKT的磷酸化水平，這說明貝伐單抗抑制了VEGF與其受體的結(jié)合，并抑制了下游信號通路的傳導(dǎo)，在聯(lián)合用藥組中效果更加明顯。Bad是一種促凋亡蛋白，其過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Western blot結(jié)果顯示，貝伐單抗單獨(dú)使用組可增強(qiáng)凋亡蛋白Bad的表達(dá)，與順鉑聯(lián)合使用后效果更明顯，而此時(shí)更值得注意的是MMP-9蛋白的表達(dá)有了明顯的減弱。由此作者推斷，貝伐單抗聯(lián)合順鉑可協(xié)同抑制VEGF下游信號通路的傳導(dǎo)，進(jìn)而影響MMP-9蛋白的表達(dá)。這充分說明貝伐單抗的單獨(dú)使用雖可影響VEGF下游信號通路的傳導(dǎo)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但并不能減弱細(xì)胞的侵襲能力，而和化療藥物順鉑的聯(lián)合使用可減弱MMP-9蛋白的表達(dá)水平。因此，貝伐單抗聯(lián)合順鉑有可能成為治療卵巢癌的一種有效方案。