許 杰,黃巧婷，謝敏豪,嚴 翊,林家仕

當(dāng)前，運動醫(yī)學(xué)界已公認有氧運動是改善心肺耐力和預(yù)防代謝性疾病的主要干預(yù)手段。最近有研究證明，較高的心肺耐力水平可顯著降低患心血管代謝性疾病的風(fēng)險和全因死亡率。另外該研究還提出，與藥物相比，在同一時間段內(nèi)心肺耐力(cardiorespiratory fitness ,CRF)的改善對治療上述疾病更為有效，因為有氧能力的增加意味著在從事較大強度的運動或工作時，機體耐受力更強[1]。與此同時，大量研究探討了心肺耐力改善的生物學(xué)機制，其中過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子 1(peroxisome proliferators γ activated receptor coati vator-1-α，PGC-1α)是眾多學(xué)者關(guān)注的熱點。線粒體的生物合成和功能體現(xiàn)，以及有氧代謝水平都與PGC-1α息息相關(guān)[2-4]。早期研究已通過轉(zhuǎn)基因小鼠模型證實PGC-1α基因過度表達的小鼠最大攝氧量和有氧能力增加，小鼠在運動測試中完成的負荷更大[5]。還有研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α轉(zhuǎn)基因小鼠的攝氧量水平要比普通小鼠高24%，而全身和骨骼肌特異性PGC-1α敲除小鼠的運動能力出現(xiàn)明顯下降[6]。提示PGC-1α表達量的增加能夠有效提高有氧運動能力和峰值攝氧量。另有研究發(fā)現(xiàn)，5′單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)作為PGC-1α的上游調(diào)控因子，對維持細胞內(nèi)能量平衡起重要作用[7]，且AMPK可以增強PGC-1α的轉(zhuǎn)錄活性[8]。因此，AMPK是當(dāng)前研究運動誘導(dǎo)PGC-1α信號級聯(lián)的主要靶點。

運動可引起線粒體產(chǎn)生適應(yīng)性變化，比如線粒體生物合成增加，酶活性增加等，這種適應(yīng)與運動強度關(guān)系密切[9]，線粒體生物合成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路極有可能介導(dǎo)了運動改善心肺耐力的機制。因此，本研究從骨骼肌AMPK/PGC-1α通路著手，研究不同強度運動改善心肺耐力的生物學(xué)機制，為改善心肺耐力的有效運動負荷的評價提供理論支持。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象與分組

1.2 運動方案

表1 訓(xùn)練跑臺速度Table 1 Training speed

1.3 取材與測試方法

各組大鼠于訓(xùn)練結(jié)束后48 h取材。使用2%戊巴比妥鈉(0.25 ml/100 g體重)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉好后迅速分離右側(cè)比目魚肌。將分離好的比目魚肌加入RNA Stabilization Reagent(Qiagen)中，4 ℃過夜后-20 ℃保存。將剩余比目魚肌于冰上切成小塊，迅速投入液氮中，取材完成后將轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

RT-qPCR法測定AMPK(Gene ID：78975，上游引物TTTGCCCAGTTACCTCTTT，下游引物CTGGCTTGGTTCATTATTCT)和PGC-1α(Gene ID：83516，上游引物CGGAAATCATATCCAACCAG，下游引物TGAGGACCGCTAGCAAGTTTG)基因表達。使用SV Total RNA Isolation System(Promega)提取RNA，采用紫外分光光度計(島津，日本)測定A260/280比值，通過查詢Primer-BLAST檢索出相應(yīng)基因的引物序列。委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行引物設(shè)計生產(chǎn)。使用qPCR Master Mix(Promega)試劑盒在Real-time PCR System(ABI 7500，USA)中進行Real Time PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min，共50個循環(huán)。2-△△CT法進行相對定量。

Western Blot法測定AMPK(Ab80039，Abcam)、磷酸化AMPK(Ab133448，Abcam)和PGC-1α(Ab54481，Abcam)蛋白表達。內(nèi)參蛋白選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)。用Image Lab計算出目的條帶的相對含量值。

1.4 統(tǒng)計方法

使用SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有實驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間采用單因素方差分析進行比較。差異顯著性水平定義為P<0.05，非常顯著性水平定義為P<0.01。

2 研究結(jié)果

2.1 不同強度運動對大鼠比目魚肌PGC-1α、AMPK mRNA表達的影響

結(jié)果顯示，小強度組和大強度組PGC-1α mRNA表達顯著高于安靜組和中強度組。中強度組雖然也高于安靜組，但是并無顯著性差異。而中強度組AMPK mRNA表達是3個運動組中最高的，顯著高于安靜組，非常顯著高于大強度組(見表2)。

表2 不同組別大鼠比目魚肌PGC-1α、AMPK基因表達的差異(N=10)Table 2 Differences of PGC-1α and AMPK gene expression in soleus muscle of rats in different groups (N=10)

2.2 不同強度運動對大鼠比目魚肌PGC-1α、AMPK和磷酸化AMPK蛋白表達的影響

結(jié)果顯示，中強度組PGC-1α蛋白表達顯著高于安靜組。另外2個運動組雖高于安靜組，但無顯著性差異。(見表3、圖1)。

表3 各組大鼠比目魚肌PGC-1α、AMPK、磷酸化AMPK蛋白表達差異(N=10)Table 3 Differences of PGC-1α, AMPK and phosphorylated AMPK protein expression in soleus muscle of rats in each group (N=10)

圖1 大鼠比目魚肌PGC-1α、AMPK和磷酸化AMPK蛋白表達Graph 1 PGC-1α, AMPK and phosphorylated AMPK protein expression in soleus muscle of rats in different groups

3 分析討論

3.1 不同強度運動對大鼠比目魚肌PGC-1α基因和蛋白表達的影響

一次性運動和長期耐力運動均能誘導(dǎo)PGC-1α表達增加，早期的研究多集中于一次性運動引起的PGC-1α應(yīng)激反應(yīng)。Baar K發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)過6 h的一次性游泳訓(xùn)練后，骨骼肌PGC-1 mRNA和蛋白表達同時升高[11]。還有研究通過人體實驗發(fā)現(xiàn)，一次性2 h的耐力運動后即刻PGC-1α基因表達顯著增加[12]。這些研究同時發(fā)現(xiàn)PGC-1α及其家族成員對線粒體生物合成作用增加有重要調(diào)控作用，這為后續(xù)研究PGC-1α與有氧代謝及心肺耐力的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。在PGC-1α功能確定之后，大量研究開始關(guān)注長期運動干預(yù)對PGC-1α的影響以及PGC-1α上下游調(diào)控因子的變化。Short R等發(fā)現(xiàn)，受試者經(jīng)過16周的有氧自行車運動后骨骼肌PGC-1α基因表達顯著增加，同時受試者峰值攝氧量增加幅度平均達到了10%以上。Pilegaard H等[13]的研究設(shè)計對比了7名受試者運動腿和非運動腿經(jīng)過4周訓(xùn)練后的結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)運動腿的PGC-1α mRNA表達顯著高于非運動腿，而且峰值表達量出現(xiàn)在運動后2 h。Russell P等人發(fā)現(xiàn)經(jīng)過6周的耐力訓(xùn)練后，PGC-1α mRNA和蛋白表達均增加了2倍以上[12]。還有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過12周有氧耐力和力量訓(xùn)練結(jié)合的運動干預(yù)方式可使中年受試者股外側(cè)肌PGC-1α蛋白表達顯著增加[14]。還有兩項研究通過動物實驗證實了4周和8周的耐力訓(xùn)練均可以顯著增加小鼠骨骼肌PGC-1α mRNA的表達[15-16]。近來的研究確認了PGC-1α在調(diào)節(jié)能量代謝中的核心作用。有研究發(fā)現(xiàn)運動可引起骨骼肌PGC-1α轉(zhuǎn)錄上調(diào)，從而起到防止線粒體內(nèi)某些酶含量下降的作用[17]。另有研究表明，運動訓(xùn)練對維持線粒體含量具有重要作用，而這種效果與PGC-1α密不可分[18]。以上多項研究均發(fā)現(xiàn)耐力運動能夠誘導(dǎo)骨骼肌PGC-1α增加。而且大部分研究同時發(fā)現(xiàn)了線粒體生物合成增加、線粒體功能增強、有氧代謝酶活性增加、攝氧量提高等現(xiàn)象。這表明PGC-1α可能在調(diào)節(jié)和協(xié)調(diào)能量代謝作用中起著及其重要的作用。早期的研究也做過小動物氣體代謝實驗，但總體上受實驗技術(shù)和條件所限，只能探索肌肉有氧代謝酶和最大攝氧量及運動能力的關(guān)系[19]。近年來研究方式在分子生物學(xué)發(fā)展的推動下已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)殄^定一些代謝調(diào)控的重點因子。2008年，Calvo等人通過轉(zhuǎn)基因小鼠模型證實了PGC-1α與運動能力密切相關(guān)[5]。該研究明確提出體內(nèi)骨骼肌PGC-1α的上調(diào)能夠極大地改善各種鍛煉模式下的運動表現(xiàn)和最大攝氧量。隨后， Tadaishi的研究團隊制作了骨骼肌PGC-1α-b過表達的小鼠。他們發(fā)現(xiàn)相比野生型小鼠，該轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌有氧代謝能力顯著提升，這有助于提高小鼠的最大攝氧量和運動能力[19]。

本研究為了探討運動強度對骨骼肌PGC-1α表達的差異影響，設(shè)計了3個運動強度。而且隨著大鼠最大攝氧量不斷提高，訓(xùn)練時采用的跑速也有所增加?？傮w來看，本研究選取的3個運動強度都可以使骨骼肌PGC-1α產(chǎn)生一定適應(yīng)性變化。

結(jié)合前人的研究，不難看出運動強度確實會對PGC-1α表達產(chǎn)生影響。只是強度設(shè)定不同所產(chǎn)生的結(jié)果不一致。本研究選取的中強度和大強度兩個負荷最終跑速要比前面幾項研究大，而小強度負荷處于適中的水平。這表明中強度運動足夠引起骨骼肌PGC-1α蛋白表達增加。而隨著運動能力的提升，小強度運動在經(jīng)過足夠長的時間后，也會出現(xiàn)心肺耐力升高的有利信號。這提示我們運動強度可能并非越大越好，因為中低強度的運動可能達到和大強度運動同樣的效果。

3.2 不同強度運動對AMPK/PGC-1α信號通路的影響

近年來，也有多項研究報道了耐力運動促進AMPK表達，從而導(dǎo)致線粒體生成和有氧耐力的提高[22-23]。AMPK是對能量變化和能量轉(zhuǎn)換極其敏感的一種激酶，運動應(yīng)激正是通過AMPK來調(diào)節(jié)PGC-1α以達到上述效果[24]。研究表明AMPK和PGC-1α之間有極其緊密的關(guān)系。AMPK和PGC-1α調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄基因大部分是相同的，AMPK可以直接作用于PGC-1α并使其磷酸化，從而增加了PGC-1α的轉(zhuǎn)錄活性[25-26]。另外Li等研究表明[21]，小鼠經(jīng)過12周耐力訓(xùn)練后，AMPK蛋白表達增加，PGC-1α mRNA表達增加，雖然PGC-1α 蛋白表達無顯著性變化，但PGC-1α去乙酰化水平非常顯著增加，也就是說所激活的PGC-1α增多了。另有一項研究表明，經(jīng)過36周耐力訓(xùn)練后，大鼠骨骼肌PGC-1α蛋白表達量顯著上升。而AMPK蛋白表達量無明顯變化[27]。

大部分文獻都未詳細探討運動強度對AMPK/ PGC-1α信號通路的影響，只有極少數(shù)研究報道了不同運動強度可能干預(yù)效果不同。有研究發(fā)現(xiàn)，分別以80%和120%乳酸閾強度運動1 h后，較大運動強度的一組受試者其骨骼肌PGC-1α蛋白表達顯著增加，但80%乳酸閾強度組升高幅度不大[28]。該研究提出隨著運動持續(xù)時間增長，ATP/AMP比值下降，磷酸肌酸和肌糖原不斷被消耗，此時能量出現(xiàn)暫時虧空，AMPK就會被激活，進而刺激PGC-1α表達增加。前文提到的Oliveira R的研究也發(fā)現(xiàn)，相對較大速度的運動干預(yù)可以導(dǎo)致磷酸化AMPK和SIRT1表達增加，同PGC-1α變化趨勢一致[16]。他們認為較高強度的訓(xùn)練可以有效提高骨骼肌AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表達而這種顯著增加的效果是低強度運動達不到的。

4 結(jié)論

(1)隨著運動強度的增加，骨骼肌AMPK的活化水平增加。

(2)運動強度越大不代表PGC-1α蛋白表達會越高。

(3)中強度運動對AMPK/PGC-1α信號通路的影響可能更有益于心肺耐力的提升。