張 琳， 陳 彥 宏， 王 雪 妍， 解 曉 彤， 李 亞 靜， 金 朝 霞

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

三七(PanaxnotoginsengF.H.Chen)，又名田七，主產(chǎn)于云南文山州，其干燥根和根莖可以入藥，具有很高的藥用價(jià)值[1]。植物內(nèi)生菌對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和系統(tǒng)演化發(fā)揮重要作用，如產(chǎn)皂苷、產(chǎn)生激素促進(jìn)植物生長(zhǎng)、抗氧化能力等。何秀麗等[2]發(fā)現(xiàn)重樓的內(nèi)生菌有多種生理活性，如抑制其他微生物活性、抗腫瘤細(xì)胞活性等，部分內(nèi)生菌發(fā)酵液可產(chǎn)生宿主重樓植物中主要活性物質(zhì)甾體皂苷。徐幼平等[3]發(fā)現(xiàn)噴施含IAA的細(xì)菌發(fā)酵液能使玉米和番茄植株內(nèi)源IAA水平上升，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。目前有關(guān)植物促生菌報(bào)道較多的是植物根際促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)，主要具有產(chǎn)鐵元素、解磷、水解酶活性、產(chǎn)IAA、產(chǎn)ACC等能力，而對(duì)于植物內(nèi)生菌方面的研究較少。

前期實(shí)驗(yàn)篩選研究了3種三七內(nèi)生細(xì)菌PN8、PN12、PN15產(chǎn)皂苷的類(lèi)型及含量。本實(shí)驗(yàn)對(duì)這3種內(nèi)生細(xì)菌的促生作用及機(jī)理、內(nèi)生定殖能力等方面進(jìn)行了測(cè)定，并利用16S rDNA序列進(jìn)行分析鑒定。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

菌種為實(shí)驗(yàn)室從三七中分離純化的3株內(nèi)生細(xì)菌，在牛肉膏蛋白胨斜面上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

ACC，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；α-丁酮酸，上海麥克林生化技術(shù)有限公司；PCR試劑和DNA marker，大連寶生物工程公司；鉻天青S，上海源葉生物科技有限公司；Salkowski試劑：1 mL 0.5 mol/L FeCl3溶液與50 mL體積分?jǐn)?shù)35%的高氯酸溶液混合；其他試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0～7.4。

DF培養(yǎng)基：Na2HPO46.0 g/L，KH2PO44.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，葡萄糖2.0 g/L，葡萄糖酸2.0 g/L，檸檬酸2.0 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 1 mg/L，H3BO310 μg/L，MnSO4·H2O 11.19 μg/L，ZnSO4·7H2O 124.6 μg/L，CuSO4·5H2O 78.22 μg/L，MnO310 μg/L，pH 7.2。

ADF液體培養(yǎng)基：將配制的0.5 mol/L ACC溶液經(jīng)0.2 μm的濾膜抽濾除菌后，加入不含(NH4)2SO4的DF培養(yǎng)基中，終濃度為3.0 mmol/L。

KB液體培養(yǎng)基：甘油 10 mL/L，胰蛋白胨20 g/L，K2HPO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，pH 7.0。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的ACC脫氨酶活性測(cè)定

ACC脫氨酶活性的測(cè)定按照Magnucka等[4]的方法稍加改進(jìn)。液體培養(yǎng)3種內(nèi)生菌來(lái)制備粗酶液。分別向得到的3種粗酶液中各加入0.5 mol/L ACC進(jìn)行酶解反應(yīng)，同時(shí)添加不加ACC的對(duì)照組，在540 nm處測(cè)吸光度。α-丁酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制參照李鄭義[5]的方法。ACC脫氨酶酶活性的定義為每毫升粗酶液每小時(shí)產(chǎn)生1 μmol α-丁酮酸為一個(gè)酶活力單位(U/mL)。

1.2.2 菌株產(chǎn)IAA的能力

1.2.2.1 比色法測(cè)定IAA的產(chǎn)量

參照比色法加以改進(jìn)，將菌株分別在不含色氨酸與含有200 μg/mL色氨酸的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d。菌液離心后，取等量上清液與Salkowski試劑混勻，暗反應(yīng)20 min。在530 nm 處測(cè)定吸光度。IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制參照文獻(xiàn)[6]的方法。

1.2.2.2 高效液相色譜法檢測(cè)IAA產(chǎn)量

將菌株在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d。未接菌的培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。按照文獻(xiàn)[7]方法對(duì)菌株IAA提取、純化后產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定。

測(cè)定條件：流動(dòng)相為體積比1∶1的1%乙酸和甲醇，體積流量0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

1.2.3 嗜鐵能力測(cè)定

采用CAS檢測(cè)法[8]測(cè)定細(xì)菌的產(chǎn)嗜鐵素能力。將菌株接種于KB培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，取出后離心，取上清液加入等量的CAS檢測(cè)液，觀察顏色變化，若顏色變?yōu)辄S綠色，表明菌株具產(chǎn)嗜鐵素能力。以培養(yǎng)基作空白對(duì)照。

1.2.4 溶磷能力測(cè)定

采用磷酸鈣平板檢測(cè)法測(cè)定溶磷能力。將菌株接種至NA培養(yǎng)液中培養(yǎng)5 d，觀察培養(yǎng)基情況，若變透明顯示細(xì)菌具有解磷能力，根據(jù)透明圈大小判斷細(xì)菌解磷能力強(qiáng)弱。

1.2.5 水解酶活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9]的方法，將菌株接種至選擇性培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d后觀察有無(wú)透明圈，記錄大小。

1.2.6 16S rDNA基因序列分析菌種鑒定

參照文獻(xiàn)[10]的方法對(duì)16S rDNA序列擴(kuò)增和分析，提取菌株P(guān)N8、PN12、PN15的總DNA。27F5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′和1492R 5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′為引物，對(duì)3株菌株的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增?；厥盏腜CR產(chǎn)物送至生物公司進(jìn)行測(cè)序。將所得的序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸序列進(jìn)行BLAST分析比對(duì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的ACC脫氨酶活性

分別對(duì)3株菌株進(jìn)行ACC脫氨酶活性測(cè)定，結(jié)果如圖1所示，PN8、PN12、PN15的ACC脫氨酶活性分別為4.72、6.79、4.93 U/mL。其中菌株P(guān)N12的ACC脫氨酶活性最高。ACC脫氨酶活力是考評(píng)植物根際和內(nèi)生促生菌促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)能力的重要指標(biāo)之一，對(duì)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育及提高植物拮抗各種脅迫起到重要作用。從藥用植物三七中篩選出來(lái)的三株細(xì)菌PN8、PN12、PN15均具有ACC脫氨酶活性，但酶活性有待進(jìn)一步提高。

圖1 3株內(nèi)生菌的ACC脫氨酶活性Fig.1 ACC deaminase activities of three endophytic bacteria

2.2 菌株產(chǎn)IAA的能力檢測(cè)

2.2.1 比色法測(cè)定IAA的產(chǎn)量

如圖2所示，菌株P(guān)N8、PN12、PN15在不含色氨酸的培養(yǎng)基中，IAA產(chǎn)量分別為0.99、1.54、2.76 μg/mL，在含200 μg/mL色氨酸的培養(yǎng)基中，IAA產(chǎn)量分別為2.97、6.36、14.50 μg/mL。3種內(nèi)生菌均在色氨酸培養(yǎng)基中IAA的合成量較高，說(shuō)明色氨酸的存在能較明顯地增加菌株對(duì)IAA產(chǎn)量，表明色氨酸是細(xì)菌IAA生物合成途徑的前體物質(zhì)[10]。

2.2.2 高效液相色譜檢測(cè)IAA產(chǎn)量

利用高效液相色譜法進(jìn)一步測(cè)定內(nèi)生細(xì)菌IAA產(chǎn)量，結(jié)果如圖3所示。標(biāo)準(zhǔn)品IAA出峰時(shí)間為15.473 min，菌株P(guān)N8、PN12和PN15的出峰時(shí)間分別為15.520、15.545、15.544 min；峰面積分別為11 819、15 272、30 429 mV·min。表明菌株P(guān)N8、PN12、PN15均可分泌IAA。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性回歸方程為Y=10 998X+425.62，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為0.999 31。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程進(jìn)行計(jì)算得到菌株P(guān)N8、PN12、PN15分泌IAA的量分別為0.989、1.529、2.750 μg/mL。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，3株內(nèi)生菌的產(chǎn)量較文獻(xiàn)[7]中報(bào)道的少，可以從IAA的提取處理方法及菌體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)條件等方面加以改進(jìn)。

圖2 3株內(nèi)生菌在不同培養(yǎng)基中的IAA產(chǎn)量Fig.2 IAA yields of three endophytic bacteria in different culture

2.3 嗜鐵能力、溶磷能力、水解酶活性檢測(cè)

嗜鐵能力、溶磷能力、水解酶活性測(cè)定結(jié)果如圖4所示。根據(jù)CAS檢測(cè)法測(cè)定嗜鐵能力(圖4(A))，菌株P(guān)N8、PN15反應(yīng)后均變?yōu)辄S綠色，說(shuō)明產(chǎn)嗜鐵素；菌株P(guān)N12則沒(méi)有變?yōu)辄S綠色，說(shuō)明不產(chǎn)嗜鐵素。溶解磷酸鈣平板培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)(圖4(B))可以看出，3株內(nèi)生菌都具有溶磷特性，溶磷能力由高到低依次為PN15、PN8、PN12。將菌株分別在蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、纖維素酶選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d，觀察透明圈大小，測(cè)定水解能力培養(yǎng)。結(jié)果表明，3株菌都具有淀粉酶水解活性(圖4(C))；PN12和PN15具有淀粉酶水解活性，PN15的較高(圖4(D))；PN12具有一定的果膠酶水解活性(圖4(E))。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。

綜上，實(shí)驗(yàn)中篩選獲得的3株三七內(nèi)生細(xì)菌所具有的嗜鐵和溶磷能力，以及多種水解酶特性，對(duì)于內(nèi)生細(xì)菌在植物體中的穿梭定殖和對(duì)宿主植物發(fā)揮促生作用具有一定的意義。

2.4 16S rDNA基因序列分析結(jié)果

將測(cè)得的菌株P(guān)N8、PN12、PN15的16S rDNA 基因組序列分析在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取序列相近的模式菌株，用Mega 5.1軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，3株菌株分別與產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、普城沙雷菌(Serratiaplymuthica)、嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)的同源性最高，遺傳進(jìn)化距離分別與產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)、普城沙雷菌(S.plymuthica)、嗜麥芽窄食單胞菌(S.maltophilia)最近，并在同一分支中，初步鑒定PN8為產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)，PN12為普城沙雷菌(S.plymuthica)，PN15為嗜麥芽窄食單胞菌(S.maltophilia)。

(a) 標(biāo)準(zhǔn)品

(b) PN8

(c) PN12

(d) PN15

A,嗜鐵能力；B,溶磷能力；C,蛋白酶活性；D,淀粉酶活性；E,果膠酶活性；F,纖維酶活性

表1 3株內(nèi)生菌的嗜鐵能力、溶磷能力、水解酶活力的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.1 The statistical result of siderophore production， dissolving phosphate and the activities of hydrolytic enzymes of three endophytic bacteria

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究的3種三七內(nèi)生細(xì)菌均具有多種促生能力，并且擁有嗜鐵能力、解磷、水解酶活性、產(chǎn)IAA、產(chǎn)ACC等能力，其中菌株P(guān)N12產(chǎn)ACC脫氨酶的能力最強(qiáng)，達(dá)6.79 U/mL；同時(shí)也具有產(chǎn)IAA和溶磷能力，具有蛋白酶、淀粉酶、果膠酶和纖維素酶活性。菌株P(guān)N15產(chǎn)IAA的能力最強(qiáng)，達(dá)2.75 μg/mL，同時(shí)具有產(chǎn)ACC、嗜鐵和溶磷能力，具有蛋白酶和淀粉酶活性。菌株P(guān)N8產(chǎn)ACC脫氨酶和產(chǎn)IAA的能力較弱，具有溶磷能力和蛋白酶活性。對(duì)3種內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA 序列分析，表明菌株P(guān)N8、PN12分別屬于產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)、普城沙雷菌(S.plymuthica)、嗜麥芽窄食單胞菌(S.maltophilia)。

(a) PN8

(b) PN12

(c) PN15