莊亦暉，龔 燕，許曉峰，盧仁泉，高 翔，郭 林

（復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科 復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032）

梅毒是一種嚴重危害人體健康的性傳播疾病，現(xiàn)已成為全世界顯著的公共衛(wèi)生問題之一[1]，其病原體為梅毒螺旋體（Treponema pallidum，TP）。目前，TP尚不能在體外培養(yǎng)，因此測定血清中的TP抗體就成為臨床診斷梅毒感染的主要途徑。血清學診斷方法主要分為2類：第1類為非TP抗原血清試驗，檢測的是針對類脂抗原的抗體，即反應素，常用方法有性病研究實驗室試驗、快速血漿反應素環(huán)狀卡片（rapid plasma reagin，RPR）試驗、甲苯胺紅不加熱血清試驗（tolulized red unheated serum test，TRUST）等；第2類為TP抗原血清試驗，檢測的是TP的特異性抗體，主要有梅毒螺旋體血凝試驗、梅毒螺旋體明膠凝集試驗（Treponema pallidum particle assay，TPPA）、熒光密螺旋體抗體吸附試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）、免疫層析法、化學發(fā)光法（chemiluminescence immunoassay， CLIA）及免疫印跡法等。如果第1類試驗有反應性，需經(jīng)第2類試驗證實，以排除假陽性。本研究擬評估免疫層析法和化學發(fā)光微粒子免疫分析法（chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA）在檢測TP特異性抗體中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

350份血清樣本均來自復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院門診及住院術(shù)前檢查患者，其中男性樣本194例、女性樣本156例，年齡45~67歲。

1.2 儀器與試劑

TPPA試劑購自日本伯樂富士瑞必歐株式會社。Determine Syphilis TP抗體膠體硒法試劑（免疫層析法）購自美國雅培公司。ARCHITECT Syphilis TP試劑（CMIA）購自美國雅培公司，檢測儀器為ARCHITECT i2000SR全自動化學發(fā)光免疫分析儀（美國雅培公司）。免疫印跡法試劑購自歐蒙醫(yī)學診斷（中國）有限公司。TRUST試劑購自上海榮盛生物有限公司。

1.3 方法

350份樣本首先采用TPPA和TRUST測定，然后采用免疫層析法和CMIA平行檢測，2種方法檢測結(jié)果不一致的樣本再用免疫印跡法復核。所有操作和結(jié)果判讀均嚴格參照試劑和儀器說明書。免疫層析法以檢測試紙條上質(zhì)控線和檢測線均出現(xiàn)為樣本有反應性。CMIA以相對發(fā)光值（relative light unit，RLU）與校準品臨界值的比值（S/CO）報告，S/CO≥1.0為樣本有反應性。根據(jù)TPPA檢測結(jié)果分組：第1組125份樣本，為TPPA有反應性；第2組25份樣本，為TPPA 1∶80弱反應性；第3組200份樣本，為TPPA陰性。第1組和第2組合計150份樣本用于方法敏感性評價。第3組200份樣本用于方法特異性評價。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5.0版進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

第1組和第2組150份樣本中，免疫層析法檢出有反應性樣本145份，5份未檢出（樣本號為1～5號），敏感性為96.7%（145/150）；CMIA檢出有反應性樣本150份，敏感性為100.0%（150/150），2種方法的敏感性差異無統(tǒng)計學意義（χ2=3.3，P＞0.05）。第3組200份樣本中，免疫層析法檢出弱反應性樣本8份（樣本號為6～13號），CMIA檢出有反應性樣本16份（樣本號為6、7、10、11、13～24號）。免疫層析法與TPPA有13份樣本的檢測結(jié)果不一致，2種方法的一致率為96.3%（337/350）；CMIA與TPPA有16份樣本的檢測結(jié)果不一致，2種方法的一致率為95.4%（334/350）。見表1。

對24份檢測結(jié)果不一致的樣本采用免疫印跡法進行復核。第1組和第2組中免疫層析法未檢出的5份樣本（樣本號為1～5號）免疫印跡法結(jié)果均為有反應性，其中1、3、5號樣本在TpN47條帶處顯示較淡條帶。在第3組免疫層析法有反應性的8份樣本（樣本號為6～13號）中，7號和10號樣本的免疫印跡法結(jié)果為有反應性；在CMIA有反應性的16份樣本（樣本號為6、7、10、11、13～24號）中，7、10、17、21和23號樣本的免疫印跡法結(jié)果為有反應性，但這5份樣本缺乏臨床信息來支持疾病的進一步明確診斷，為不確定結(jié)果，需要今后跟蹤隨訪，因此這5份暫不作為陰性樣本；此外，6、13、14、16、18和20號樣本的免疫印跡法結(jié)果為臨界，作為陰性結(jié)果處理。因此，最終校正后的方法特異性如下：免疫層析法的特異性為98.5%（192/195），CMIA的特異性為94.4%（184/195），2種方法的特異性差異無統(tǒng)計學意義（χ2=3.6，P＞0.05）。見表2、表3。

表1 免疫層析法和CMIA的檢測結(jié)果

表2 24份檢測結(jié)果不一致樣本的免疫印跡法結(jié)果

續(xù)表2

表3 24份檢測結(jié)果不一致樣本的免疫印跡法結(jié)果匯總

3 討論

在過去30多年中，TP細胞壁脂蛋白的分離與提純以及基因重組技術(shù)的出現(xiàn)，使TP的實驗室檢測技術(shù)飛速發(fā)展，其中最常見的4個用于TP特異性抗體檢測的特異性多肽是TpN15、TpN17、TpN45和TpN47[2]。本研究評估的免疫層析法和CMIA包被抗原中均包含TpN47。TpN47具有免疫原性強、誘導早期體液免疫及其抗體存在于未治療梅毒的各個階段等特點[3]。

本研究結(jié)果顯示免疫層析法的敏感性和特異性分別為96.7%、98.5%；CMIA的敏感性和特異性分別為100.0%、94.4%，2種方法的敏感性和特異性差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），可以滿足不同實驗室的檢測需求。

在敏感性方面，CMIA檢測出了所有TPPA有反應性和1∶80弱反應性的樣本，顯示出很高的敏感性，與文獻報道[4-5]一致。這可能與其試劑中聯(lián)合包被3種重組抗原（TpN15、TpN17、TpN47）有關(guān)，與免疫層析法試劑僅包被TpN47抗原相比，更廣的抗原譜提升了對TP特異性抗體的檢測能力。免疫層析法未檢出的5份TPPA有反應性的樣本，免疫印跡法均出現(xiàn)了2條以上的特異性條帶，結(jié)果為有反應性，其中有3份樣本的TpN47條帶較淡，因此樣本中相應抗體的濃度較低。由此推測這5份樣本均有可能是因為抗體濃度過低、降低了抗原抗體反應的強度而導致免疫層析法出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

在特異性方面，CMIA在梅毒低危人群中有一定比例的假陽性。這種現(xiàn)象最先由美國疾病預防控制中心報道：在梅毒低危人群中，如ELISA或CLIA檢測TP特異性抗體有反應性，但RPR試驗或TRUST檢測無反應性且TPPA也無反應性，則可排除TP感染[6-7]。出現(xiàn)這種假陽性現(xiàn)象的原因至今不甚明了，有可能是體內(nèi)共生螺旋體產(chǎn)生的交叉抗體[8]。本研究結(jié)果顯示，在去除免疫印跡法結(jié)果為臨界的5份樣本后，在其他195份TPPA無反應性樣本中，CMIA有11份樣本（5.6%）可能為假陽性結(jié)果，這11份樣本免疫印跡法結(jié)果為6份可疑、5份陰性；免疫層析法有4份樣本為弱反應性，其中3份樣本的免疫印跡法結(jié)果出現(xiàn)單條TpN47條帶，確切原因未知。BAKER-ZANDER等[9]的研究結(jié)果顯示，正常人血清中可存在少量與TpN47發(fā)生反應的免疫球蛋白。這可能是免疫層析法出現(xiàn)弱反應性的原因之一。

聯(lián)合國開發(fā)規(guī)劃署、世界銀行、世界衛(wèi)生組織的性傳播疾病診斷規(guī)劃組對6種檢測TP特異性抗體的快速診斷產(chǎn)品的聯(lián)合評估結(jié)果顯示，免疫層析法的敏感性和特異性分別為97.2%、94.1%[10]，與本研究結(jié)果相似。因免疫層析法具有操作簡便、結(jié)果直觀、可采用全血進行檢測的特點，所以被世界衛(wèi)生組織推薦至疾病高發(fā)地區(qū)或發(fā)展中國家的基層診所或?qū)嶒炇疫M行進一步評估。由此可見，在梅毒高發(fā)人群中可以先用免疫層析法進行篩查，并結(jié)合TRUST或RPR試驗確定患者是否為新發(fā)感染。SIEDNER等[11]采用免疫層析法檢測了梅毒高風險患者的全血樣本，結(jié)果顯示敏感性和特異性均為100% 。

篩查TP感染以往最普遍的方法是TRUST或RPR試驗，考慮到其生物假陽性現(xiàn)象，需用TPPA加以確認，而基層醫(yī)療機構(gòu)中往往因樣本量少以及試劑、儀器、人員、技術(shù)等因素而不開展TPPA，因此更趨于選擇對操作者技術(shù)要求不高的免疫層析法。在大型綜合性醫(yī)院、專科醫(yī)院以及采供血醫(yī)療機構(gòu)中，日益增加的樣本量使得以手工操作為主的TPPA面臨嚴峻挑戰(zhàn)，而可以實現(xiàn)自動化操作的ELISA和CLIA能滿足實驗室高通量檢測的需求，因此TP的實驗室篩查逐漸由傳統(tǒng)流程轉(zhuǎn)向反向流程[12]。

綜上所述，免疫層析法具有操作簡便、無需額外儀器，獲取結(jié)果時間短的優(yōu)點，適用于基層醫(yī)療機構(gòu)和邊遠地區(qū)的產(chǎn)前篩查。CMIA具有高通量、數(shù)據(jù)易于保存等諸多優(yōu)點，在梅毒反流程篩查方案中可作為一線篩查試驗，適用于樣本量大的大型實驗室。總之，CMIA、免疫層析法具有很好的敏感性和特異性，且與TPPA具有較好的一致性，可用于臨床檢測。