申宇鵬，李曉明，靳海峰，賈立峰，陶振峰，宋 琦

喉腔是人體重要的組織器官，具有發(fā)音、呼吸、吞咽、防御等重要生理功能，喉部病變?nèi)缥吹玫郊皶r(shí)有效的治療，往往會(huì)影響患者重要生理功能甚至危及生命，探索有效途徑進(jìn)行喉癌的綜合輔助治療成為頭頸腫瘤相關(guān)研究熱點(diǎn)[1]。喉癌及癌前病變的發(fā)生及惡性進(jìn)展都處在機(jī)體生理環(huán)境中，受到內(nèi)源性生長因子及相應(yīng)受體調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的營養(yǎng)支持。圍繞喉癌發(fā)病機(jī)制中表皮生長因子及其受體(epidermal growth factor receptor， EGFR)[2]、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)[3]、低氧誘導(dǎo)因子(HIF)[4]的作用都有研究報(bào)道。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor， NGF)歸屬神經(jīng)營養(yǎng)素家族的成員，擁有酪氨酸蛋白激酶A(tyrosine kinase A， TrkA)及p75NTR受體，以往圍繞神經(jīng)生長因子及其受體的研究多限于神經(jīng)系統(tǒng)[5-6]，在頭頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及相關(guān)研究少有報(bào)道。我們前期研究已經(jīng)證實(shí)，TrkA受體的高表達(dá)與喉癌的惡性進(jìn)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈明顯相關(guān)[7]。本研究針對(duì)NGF及p75NTR受體在喉癌前病變及喉癌組織中的表達(dá)進(jìn)行分析探討。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源及分組 標(biāo)本選自解放軍白求恩國際和平醫(yī)院2006年7月—2009年7月經(jīng)手術(shù)切除的喉鱗狀細(xì)胞癌組織42例，喉不典型增生病變14例，喉乳頭狀瘤6例，取正常喉黏膜11例作為對(duì)照組。喉鱗狀細(xì)胞癌組中男36例，女6例，平均年齡61歲。根據(jù)國際抗癌協(xié)會(huì)(UICC)標(biāo)準(zhǔn)(2002)劃分TNM分期。依據(jù)病理學(xué)診斷結(jié)果分組:高分化組(鱗癌Ⅰ級(jí))21例,中、低分化組(鱗癌Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí))21例;根據(jù)術(shù)后病理報(bào)告分組:伴頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組20例，無轉(zhuǎn)移組22例。喉乳頭狀瘤組男6例，平均年齡53歲；不典型增生組男12例，女2例，平均年齡55歲；正常對(duì)照組男9例，女2例，平均年齡56歲。3組病例均經(jīng)病理學(xué)診斷明確。3組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具有可比性。所有標(biāo)本均經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24 h,石蠟包埋切片,切片厚5 μm,每例標(biāo)本先經(jīng)蘇木精及伊紅(HE)染色觀察病理學(xué)特征,再進(jìn)行免疫組化染色。

1.2抗體、試劑盒及儀器設(shè)備 p75NTR兔抗人單克隆抗體(ab52987)購自Abcam公司；Ki67單克隆抗體(sc-23900)及p63單克隆抗體(sc-8431)為Santa Cruz公司生產(chǎn)；β-NGF兔抗人多克隆抗體(bs-0067R)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；即用型免疫組化試劑盒(SP-9002)及HRP-山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。熒光顯微鏡(DMIRB，德國Leica)；石蠟切片機(jī)(RM2135，德國Leica)；組織包埋機(jī)(EG1140C，德國Leica)。

1.3免疫組化染色 石蠟標(biāo)本行連續(xù)切片，先經(jīng)脫蠟及乙醇水化后高壓抗原修復(fù)，然后給予免疫組化染色，采用常規(guī)SP法，將上述準(zhǔn)備組織切片滴加3%過氧化氫溶液滅活過氧化物酶活性；山羊血清封閉非特異性顯色；滴加一抗(p75NTR單克隆抗體稀釋度1∶50)4℃孵育過夜；陰性對(duì)照組添加PBS抗體稀釋液代替一抗；經(jīng)二抗、辣根鏈霉素卵白素作用后行DAB顯色，顯色滿意后給予蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明及中性樹膠封片。

1.4結(jié)果判定 NGF陽性細(xì)胞的胞漿及胞核內(nèi)顯示棕黃色顆粒，p63及Ki67陽性顯色基本位于胞核內(nèi)。NGF染色評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(每個(gè)視野觀察細(xì)胞數(shù)≥150個(gè))，按陽性細(xì)胞所占百分比及著色深淺度分別進(jìn)行計(jì)分判定。①按視野中細(xì)胞著色深淺評(píng)分:細(xì)胞無顯色(0分)，淺棕黃色(1分)，深棕黃色(2分)。②按陽性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞數(shù)百分比評(píng)分：<5%為0分，5%～20%為1分，20%～40%為2分，40%～60%為3分，<61%為4分。?、佟ⅱ趦身?xiàng)分值相加為最后得分：0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，≥4分為強(qiáng)陽性(++)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1正常喉黏膜中NGF及p75NTR的表達(dá) 正常喉黏膜的復(fù)層鱗狀上皮主要包括：基底層、副基底層、棘狀層、顆粒層、角質(zhì)層。喉黏膜中NGF染色非常淺淡，陽性細(xì)胞呈胞漿淺淡著色，部分伴隨胞核顯色，NGF陽性細(xì)胞主要分布于黏膜的基底層、副基底層和棘狀層，上棘狀層及顆粒層罕見顯色。參照預(yù)設(shè)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，NGF表達(dá)分布與TrkA表達(dá)區(qū)域基本一致[7]，靠近黏膜表層著色淺淡。p75NTR陽性細(xì)胞主要為胞膜顯色，部分細(xì)胞的胞漿也有顯色。p75NTR僅表達(dá)于正常黏膜鱗狀上皮的基底層細(xì)胞，其他黏膜上皮層均無顯色。p75NTR陽性細(xì)胞于基底膜上方呈單排整齊排列，與下方間質(zhì)組織分界清晰。p63陽性細(xì)胞主要分布于上皮的基底層和副基底層，胞核呈棕黃色，在黏膜基底層附近p63陽性細(xì)胞最密集。Ki67陽性細(xì)胞分布于副基底層附近，基底層無顯色。相鄰切片對(duì)比發(fā)現(xiàn)，p75NTR陽性染色嚴(yán)格分布于喉黏膜鱗狀上皮的基底層，與上方的Ki67陽性細(xì)胞層緊密相貼(見圖1，紅色箭頭標(biāo)示陽性細(xì)胞)。

圖1 正常喉黏膜中神經(jīng)生長因子、p75NTR及相關(guān)蛋白的表達(dá)(DAB×200)

2.2喉不典型增生黏膜中NGF及p75NTR的表達(dá) 對(duì)經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的喉不典型增生黏膜進(jìn)行染色，NGF及p75NTR的表達(dá)均高于正常喉黏膜。不典型增生黏膜中p75NTR染色的強(qiáng)陽性率為57.1%,p75NTR表達(dá)已不局限于基底層，在副基底層及周圍層中也有分布，靠近基底部的染色較深，細(xì)胞膜及胞漿都有著色(圖2A)。NGF計(jì)數(shù)強(qiáng)陽性率僅為14.3%，NGF表達(dá)升高表現(xiàn)為陽性著色加深及分布范圍變廣，重度不典型增生中NGF陽性細(xì)胞廣泛分布至全層上皮，胞漿顯色更加明顯(圖2B)。NGF染色與Ki67染色分布區(qū)域相近，形態(tài)學(xué)分析NGF及p75NTR的高表達(dá)與上皮細(xì)胞的高增殖活力相伴隨(圖2C)。

圖2 喉部重度不典型增生黏膜中p75NTR、神經(jīng)生長因子及Ki67的表達(dá)(DAB×200)

2.3喉乳頭狀瘤組織中NGF及p75NTR的表達(dá) 對(duì)病理學(xué)證實(shí)的7例喉乳頭狀瘤組織(4例發(fā)生癌變)做染色分析。喉乳頭狀瘤切片中p75NTR陽性細(xì)胞主要分布于腫瘤的基底細(xì)胞層，部分區(qū)域向上擴(kuò)散至副基底層，陽性細(xì)胞的胞膜及胞漿均有著色，深染色區(qū)域集中于乳頭狀外向生長的基底部。NGF的表達(dá)在喉乳頭狀瘤組織中明顯高于正常喉黏膜，乳頭狀瘤的腫瘤全層均可見NGF染色，細(xì)胞胞漿顯色為主。我們觀察到在乳頭狀瘤發(fā)生癌變的區(qū)域，NGF、p75NTR、Ki67表達(dá)均呈現(xiàn)明顯上升，該區(qū)域p75NTR陽性染色范圍擴(kuò)大，細(xì)胞極性紊亂，提示乳頭狀瘤發(fā)生癌變的細(xì)胞存在高增殖活力。見圖3。

圖3 人乳頭狀瘤組織中p75NTR、神經(jīng)生長因子及Ki67的表達(dá)(DAB×200)

2.4喉鱗狀細(xì)胞癌組織中NGF及p75NTR的表達(dá) 喉鱗狀細(xì)胞癌組織中，p75NTR的表達(dá)呈明顯的區(qū)域性分布。分化程度較高的喉鱗狀細(xì)胞癌組織中，p75NTR陽性細(xì)胞主要位于癌巢的周邊基底層細(xì)胞，以胞膜顯色為主，中央?yún)^(qū)細(xì)胞幾乎無陽性染色(圖4)，與p63的陽性分布區(qū)域基本接近。中分化喉鱗狀細(xì)胞癌組織中，p75NTR陽性細(xì)胞分布由癌巢基底層及浸潤緣擴(kuò)展至周邊范圍(圖5)。低分化喉鱗狀細(xì)胞癌組織中，p75NTR陽性染色區(qū)更為廣泛和分散，陽性細(xì)胞多數(shù)呈胞漿顯色為主，缺失了分布區(qū)域性。低分化喉鱗狀細(xì)胞癌中p75NTR陽性細(xì)胞雖然廣泛分布，但是胞膜染色強(qiáng)度有所降低。高分化喉鱗狀細(xì)胞癌中p75NTR陽性細(xì)胞多呈胞膜及胞漿顯色，而低分化喉鱗狀細(xì)胞癌中p75NTR陽性細(xì)胞少有胞膜深染，胞漿顯色為主。形態(tài)學(xué)研究證實(shí)喉鱗狀細(xì)胞癌組織中p75NTR陽性細(xì)胞的分布具有區(qū)域特異性。喉鱗狀細(xì)胞癌組織中NGF陽性染色范圍廣泛，42例標(biāo)本中僅3例(7%)呈陰性表達(dá)。多數(shù)標(biāo)本中可見NGF陽性細(xì)胞分布于腫瘤各層，以胞漿陽性染色為主，NGF染色無明顯區(qū)域性分布。與正常喉黏膜及乳頭狀瘤比較，喉鱗狀細(xì)胞癌組織內(nèi)NGF表達(dá)有所升高，強(qiáng)陽性率達(dá)52.4%。

圖4 高分化喉鱗狀細(xì)胞癌組織不同病理分級(jí)中p75NTR及神經(jīng)生長因子的表達(dá)情況(DAB×200)

圖5 中分化喉鱗狀細(xì)胞癌組織p75NTR、p63及Ki67的染色(DAB×200)

2.5喉鱗狀細(xì)胞癌組織中NGF的表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 將42例喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本根據(jù)頸部淋巴結(jié)術(shù)后病理學(xué)結(jié)果分為陽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組20例和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組22例，對(duì)2組切片的NGF表達(dá)情況進(jìn)行染色對(duì)比分析。陽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中NGF染色強(qiáng)陽性15例(75.0%)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為7例(31.82%)，陽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中NGF染色強(qiáng)陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(χ2=6.025,P<0.05)。

3 討論

NGF是神經(jīng)營養(yǎng)素家族首要成員，其擁有Trks以及p75NTR。p75NTR是腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor, TNFR)家族成員之一，廣泛分布于人體神經(jīng)、上皮等組織系統(tǒng)及相應(yīng)來源的腫瘤細(xì)胞中。研究表明，NGF等神經(jīng)營養(yǎng)因子與其受體p75NTR和TrkA結(jié)合后，對(duì)組織細(xì)胞的生長、遷徙、分化及凋亡具有調(diào)節(jié)支持作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)NGF與其受體p75NTR和TrkA之間相互調(diào)節(jié)，影響機(jī)體細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、分化。機(jī)體內(nèi)正常喉黏膜上皮由自然修復(fù)增生至惡變進(jìn)展，要經(jīng)過量變到質(zhì)變的過程，即由正常上皮、上皮增生、不典型增生至喉癌。喉癌前病變?yōu)榫植炕颦h(huán)境因素長期刺激造成的喉黏膜形態(tài)變化，疾病的進(jìn)展受到眾多生長因子及受體信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)支持。以往關(guān)于NGF及p75NTR的研究大多限于神經(jīng)系統(tǒng)，在喉黏膜、癌前病變及喉癌中的表達(dá)及功能情況少有研究報(bào)道。我們通過免疫組化觀察NGF、p75NTR、Ki67等分子在喉黏膜、癌前病變及喉癌中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究該信號(hào)通路的功能奠定基礎(chǔ)。

正常喉黏膜中NGF陽性染色主要分布于黏膜基底層、副基底層和棘狀層，靠近黏膜表層幾乎不顯色。NGF陽性細(xì)胞的分布區(qū)域與TrkA陽性細(xì)胞分布區(qū)域基本一致。相比較p63陽性細(xì)胞主要分布于鱗狀上皮的基底層、副基底層，分布范圍比NGF更局限于基底部，但缺乏p75NTR表達(dá)的特異性。本研究結(jié)果顯示，正常喉黏膜中p75NTR僅表達(dá)于基底層細(xì)胞，在基底層細(xì)胞上方的各細(xì)胞層中均未染色。p75NTR陽性細(xì)胞沿基底膜排列整齊，與下方結(jié)締組織分界清晰。p63陽性細(xì)胞分布范圍較p75NTR廣泛，在靠近黏膜基底層周圍p63陽性細(xì)胞最為密集。Ki67陽性染色細(xì)胞多數(shù)分布于副基底層周圍，基底層沒有顯色。眾所周知，Ki67陽性細(xì)胞具有旺盛的增殖活力。此外，p75NTR陽性細(xì)胞嚴(yán)格分布于Ki67染色區(qū)域相貼的下方基底層，符合黏膜上皮干細(xì)胞的特征。p75NTR陽性細(xì)胞具有自我更新、分化成熟的能力，其可作為正常喉黏膜鱗狀上皮干細(xì)胞的良好標(biāo)志物。

喉癌前病變是指臨床表現(xiàn)具有惡變潛能的喉部病變，由多種臨床癥狀、病理學(xué)特征和體征表現(xiàn)類似的疾病組成，主要包括：喉黏膜白斑病、喉角化病、喉乳頭狀瘤等。組織病理學(xué)表現(xiàn)為上皮單純增生和不典型增生。經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的喉不典型增生黏膜中，NGF及p75NTR的表達(dá)均高于正常喉黏膜。不典型增生黏膜中p75NTR表達(dá)并不局限于基底層，在副基底層及周圍層中也有分布，NGF陽性染色加深且分布范圍變廣。重度不典型增生中NGF陽性細(xì)胞廣泛分布至上皮全層，與Ki67染色分布變化一致，形態(tài)學(xué)分析NGF及p75NTR的表達(dá)升高與上皮細(xì)胞的高增殖活力相伴隨。乳頭狀瘤組織中p75NTR的深染色區(qū)域分布于腫瘤乳頭狀外向生長的基底層及副基底層。在乳頭狀瘤組織中，NGF表達(dá)高于普通黏膜上皮，特別是乳頭狀瘤發(fā)生癌變的區(qū)域，NGF、p75NTR及Ki67的表達(dá)水平相伴隨上升，p75NTR陽性細(xì)胞區(qū)域增大，細(xì)胞極性紊亂，證實(shí)乳頭狀瘤發(fā)生癌變的區(qū)域細(xì)胞具備高增殖活力。

p75NTR受體是一種單鏈跨膜糖蛋白，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包含:腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TNF-receptor associated factor， TRAF)結(jié)合位點(diǎn)、Ⅱ型死亡結(jié)構(gòu)域、G蛋白激活域等分子結(jié)構(gòu)，p75NTR的胞內(nèi)域有與受體功能無關(guān)的特殊結(jié)構(gòu)，這些都成為p75NTR介導(dǎo)多重信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基礎(chǔ)[8]。近年來NGF及p75NTR受體在多種上皮及消化系統(tǒng)腫瘤中有相關(guān)研究報(bào)道，多數(shù)研究表明，p75NTR在腫瘤的發(fā)病及進(jìn)展中具有重要作用，不同系統(tǒng)來源腫瘤中p75NTR受體通路的功能有明顯差別。現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，在胃癌[9]、膀胱癌[10]、前列腺癌[11]中p75NTR受體通路具有抑制腫瘤生長增殖的作用。對(duì)黑色素瘤[12]、食管癌[13]、舌鱗癌等研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR受體具備促進(jìn)腫瘤生存進(jìn)展的作用。p75NTR作為TNFR家族成員之一，具備抑制腫瘤細(xì)胞生長的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，已知能夠誘導(dǎo)激活下游凋亡信號(hào)通路。在對(duì)口腔鱗癌組織細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR表達(dá)的上調(diào)及其分布區(qū)域特征的改變能夠預(yù)示患者治療后復(fù)發(fā)及預(yù)后不良[14]。Kojima等[15]發(fā)現(xiàn)，p75NTR與食管鱗癌干細(xì)胞相關(guān)性密切。因此目前p75NTR在各類腫瘤中的功能尚未明確，p75NTR在不同腫瘤中發(fā)揮的作用與組織細(xì)胞類型、分化狀態(tài)及微環(huán)境有關(guān)，同時(shí)也與細(xì)胞是否同時(shí)表達(dá)TrkA相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，高分化喉鱗狀細(xì)胞癌中p75NTR陽性細(xì)胞主要分布于腫瘤癌巢周邊的基底層及與間質(zhì)接觸的浸潤緣，與p63和Ki67的染色分布區(qū)域相接近，這些基底區(qū)及浸潤緣的細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖和自我更新潛力。伴隨分化程度的降低p75NTR分布范圍更加廣泛，逐漸缺失了分布區(qū)域性，陽性染色部位由胞膜向胞漿轉(zhuǎn)化，半定量評(píng)分法尚難以分辨p75NTR表達(dá)與喉癌臨床病理因素之間的關(guān)系，但我們推測胞漿內(nèi)p75NTR表達(dá)上調(diào)與喉癌惡性進(jìn)展有關(guān)聯(lián)。目前有關(guān)NGF及p75NTR依賴的促生存機(jī)制并未闡明，p75NTR能與TrkA協(xié)同作用調(diào)節(jié)NGF依賴的TrkA活化途徑，也可以通過自身信號(hào)通路來促進(jìn)細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)凋亡。p75NTR激活NF-κB途徑促進(jìn)細(xì)胞存活已在嗜鉻細(xì)胞瘤PC12及泌乳素瘤細(xì)胞系中證實(shí)。已有研究支持TrkA受體對(duì)p75NTR受體的具體功能有直接影響，細(xì)胞中TrkA表達(dá)缺失時(shí)p75NTR能夠激活自身信號(hào)途徑，當(dāng)同時(shí)表達(dá)TrkA受體時(shí),p75NTR能夠輔助并增強(qiáng)NGF及TrkA信號(hào)通路的功能[16]。在喉癌組織中NGF及TrkA蛋白的表達(dá)已被形態(tài)學(xué)研究證實(shí)，我們推測喉癌組織中自分泌或旁分泌的NGF與p75NTR及TrkA受體一起促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。本研究結(jié)果顯示，陽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中NGF染色強(qiáng)陽性所占比例高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示喉鱗狀細(xì)胞癌組織中NGF表達(dá)的升高與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，我們前期研究發(fā)現(xiàn)TrkA的高表達(dá)與喉癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，因此NGF及TrkA受體表達(dá)增高與喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

綜上所述，NGF及p75NTR受體與喉癌的發(fā)病、生長及惡性進(jìn)展密切相關(guān)，研究如何調(diào)控或阻斷相關(guān)信號(hào)通路或許能夠?yàn)槲覀冎斡[瘤提供新的思路。