王愛軍，王娜，顧思思，趙文娟，李平，鄭愛萍*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所，四川 溫江 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)西南作物基因資源與遺傳改良教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 雅安 625014；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，四川 溫江 611130)

水稻(Oryzasativa)是我國重要的糧食作物之一，有65%的人口以稻米為主食，在糧食生產(chǎn)中具有十分重要的地位[1]。水稻紋枯病是由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)引起的一種世界性水稻病害[2]，該菌可形成抗逆性強(qiáng)的菌核結(jié)構(gòu)，在土壤中存活時間較長，發(fā)病時還可通過植物葉片橫向傳播，是一種具有土傳和葉傳雙重特性的半腐生真菌，可侵染多種寄主，一般在水稻分蘗期高溫、高濕條件下發(fā)生侵染[3-5]。近年來，隨著水稻高產(chǎn)、多蘗、粗稈大穗型栽培種的推廣，過量施用氮肥以及種植密度的加大，使田間通風(fēng)差、濕度大，為紋枯病菌侵染提供了有利的環(huán)境條件[6-7]。由水稻紋枯病菌侵染造成的病害損失達(dá)10%～50%[8-9]，且有逐年加重的趨勢，已發(fā)展成為制約我國水稻高產(chǎn)的主要病害，嚴(yán)重威脅我國的水稻生產(chǎn)[10]。

根據(jù)立枯絲核菌菌絲能否互相融合，將其劃分為至少14個融合群(anastomosis groups, AGs)，有些融合群可進(jìn)一步劃分為融合亞群[11]。近年來，相關(guān)學(xué)者對我國江蘇[12]、湖北[13]、四川[14]、廣東[21]等地水稻紋枯病菌的致病力分化和融合群進(jìn)行了廣泛研究，并取得了一些進(jìn)展。然而，全國范圍內(nèi)的水稻紋枯病菌致病力分化情況以及引起其致病力分化的可能因素尚未見報道。因此，從16個水稻主要種植區(qū)采集與水稻紋枯病癥狀類似的植株，進(jìn)行紋枯病病原菌的分離，基于其形態(tài)學(xué)特性、菌絲細(xì)胞核熒光染色和 rDNA-ITS 序列分析進(jìn)行鑒定和比較，并采用柯赫氏法則對分離自16個不同區(qū)域的病原菌致病力分化進(jìn)行測定，旨在明確水稻紋枯病菌的生物學(xué)特性、致病力分化與地理來源之間的關(guān)系，為有效地預(yù)測預(yù)報和防治該病害提供一定的理論依據(jù)；同時尋找新的、致病力差異較大的菌株，為紋枯病菌與其寄主互作研究提供更加豐富的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病株：于2015年8月，采集自黑龍江、吉林、遼寧、河南、安徽、浙江、江蘇、四川、重慶、貴州、云南、湖北、湖南、廣西、廣東、福建16個水稻種植區(qū)紋枯病樣品34份。不同菌株的致病性測定試驗(yàn)使用9311水稻品種。

PSA固體培養(yǎng)基：2%蔗糖、1.8%瓊脂粉、20%馬鈴薯，121 ℃滅菌20 min；PSA液體培養(yǎng)基：20%馬鈴薯、2%蔗糖，121 ℃滅菌20 min；WA培養(yǎng)基：1.5%瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1病樣采集及病原菌的分離 于2015年8月，分別從黑龍江等16個水稻紋枯病自然發(fā)病田中采集水稻病鞘或病葉樣本，每個采樣田塊采用對角線5點(diǎn)采樣法進(jìn)行采樣，混合分裝進(jìn)行紋枯病病原菌的分離，并描述發(fā)病樣本癥狀。病原菌的分離采用水瓊脂分離法[15]，用消毒后的剪刀剪取每個樣品病斑邊緣長寬約5 mm的病樣組織，75%的酒精消毒2 min，無菌水沖洗3次，置于裝有1/3滅菌蒸餾水的培養(yǎng)皿中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；用鑷子夾取病樣組織塊在滅菌濾紙上吸干表面水分，平鋪于WA培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h；當(dāng)病樣組織塊周圍長出2～3 cm、呈分枝狀的菌絲時，用接種鏟在單個菌絲尖端切取3～4 mm左右的菌塊轉(zhuǎn)接到PSA培養(yǎng)基上進(jìn)行菌落純化，每隔1 d觀察菌絲生長情況。所有的操作均在超凈工作臺中進(jìn)行。

1.2.2形態(tài)學(xué)鑒定 將分離到的菌株接種于PSA平板上活化，待菌落長至平板邊緣時，用打孔器在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌絲塊，接種于另一潔凈的PSA培養(yǎng)基中央，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個菌株重復(fù)3皿。每隔2 h按十字交叉法測量菌落生長直徑，期間觀察菌絲的生長形態(tài)、菌核形成時間及顏色變化等。

選擇干凈無劃痕的載玻片，蒸餾水沖洗干凈，擦干后于121 ℃高壓滅菌20 min，適度烘干后，放入95%乙醇浸泡脫水，取出載玻片，用火焰去除乙醇，冷卻后立即插入分離自不同地區(qū)水稻紋枯病菌生長的培養(yǎng)皿中，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待菌絲生長到載玻片1/2處，取出載玻片，滴取適量濃度為100 μg·mL-1的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)熒光染液于載玻片的菌絲上，蓋上蓋玻片，染色30 min，試驗(yàn)在黑暗條件下進(jìn)行；染色完成后取下蓋玻片，快速用1×PBS或蒸餾水沖洗干凈，以除去未結(jié)合的染液，用滅菌濾紙吸去多余水分，滴加1滴熒光封片液(0.5 mol·L-1磷酸鹽緩沖液與滅菌的80%甘油等體積混合)，蓋上蓋玻片，置于熒光顯微鏡下藍(lán)光通道，觀察菌絲形態(tài)和細(xì)胞核形態(tài)，并統(tǒng)計不同菌株的細(xì)胞核數(shù)[16]。

1.2.3分子生物學(xué)鑒定 分子生物學(xué)鑒定 為鑒定分離到的病原菌菌株以及紋枯菌融合亞群歸屬，對分離自16個不同地區(qū)的61株病原菌進(jìn)行rDNA-ITS序列分析。采用CTAB法提取病原菌基因組DNA[17]。rDNA-ITS序列引物為F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′； R: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，反應(yīng)體系采用50 μL體系：2 μL DNA模板，10 μL FastPfu Fly Buffer，5 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs，1 μL FastPfu Fly 高保真酶，正反引物各1 μL，用ddH2O補(bǔ)充至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。

1.2.4病原菌致病性測定 采用離體葉片接種法進(jìn)行病原菌的致病性測定。接種材料為水稻9311品種，選取水稻劍葉，均勻地平鋪于裝有濕潤濾紙的白色瓷盤上；隨機(jī)選取分離自16個不同地區(qū)的水稻紋枯病菌各1株活化，待菌落長至平板邊緣時，用打孔器在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌絲塊，接種到瓷盤中放置好的葉片中部，接種后覆蓋上保鮮膜保濕，置于28 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中，每天及時往瓷盤中添加無菌蒸餾水保證葉片的濕潤環(huán)境；每株菌重復(fù)3次，以不接菌絲塊的健康葉片為對照，于接種后24、48、72、96 h觀察葉片發(fā)病情況，并統(tǒng)計葉片病斑大小及侵染葉面積百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻紋枯病的為害癥狀

紋枯病菌主要為害葉鞘，嚴(yán)重時也可為害葉片、莖稈和穗部，整個生育期均可發(fā)生。發(fā)病初期，葉鞘表面出現(xiàn)暗綠色水漬狀斑點(diǎn)，隨后擴(kuò)大，形成有暗褐色邊緣的橢圓形病斑，后多個病斑重疊成中央灰白色或草綠色，邊緣明顯的云紋狀。潮濕時病部出現(xiàn)白色粉狀霉層，后形成褐色菌核。高溫、高濕等環(huán)境條件可促使紋枯病的發(fā)生，發(fā)病后輸導(dǎo)組織破壞，谷粒飽滿度減小，甚至不能正常抽穗，形成大量癟谷。

2.2 水稻紋枯病的分離及形態(tài)學(xué)特征

2.2.1病原菌的分離 采用水瓊脂分離法分離得到的菌株，菌絲經(jīng)過單菌絲尖端移植，轉(zhuǎn)到PSA培養(yǎng)基上純化。從黑龍江等16個不同地區(qū)共分離得到61株病原菌菌株(表1)。病原菌菌絲細(xì)而松散，多分枝，分枝為直角或接近45°的銳角，菌落后期基質(zhì)顏色變褐，產(chǎn)生多個菌核。

表1 水稻紋枯病菌的分離Table 1 The isolates of the rice sheath blight pathogen

2.2.2病原菌菌落形態(tài) 觀察分離自16個不同地理來源的病原菌菌株在PSA培養(yǎng)基上的生長變化情況(圖1)，接種后2 h菌絲開始沿菌絲塊周圍生長，不斷蔓延，菌絲初期細(xì)且密，呈白色；24 h后，菌絲生長到整個培養(yǎng)基的2/3，菌絲在加快生長的同時開始不斷稠密變粗；48 h后，菌絲長滿整個平板，產(chǎn)生少量氣生菌絲，部分菌絲聚集成團(tuán)，形成少量白色菌絲團(tuán)；72 h后，氣生菌絲不斷增多，菌絲層上形成厚密的白色菌絲團(tuán)，來源于廣東的菌株GD、廣西的菌株GX和河南的菌株ZZYY最先形成明顯白色顆粒狀的菌核；96 h后，菌絲逐漸變?yōu)辄S褐色，GD菌株產(chǎn)生少量黃褐色菌核，其他菌株可見白色菌核；7 d后，菌絲顏色加深，形成大量深褐色菌核分散于培養(yǎng)皿中，其中菌株GD和菌株GX形成的菌核大且圓，菌核之間不相連，而湖南的菌株HN形成的菌核多集中在接種點(diǎn)周圍，來源于浙江的菌株HZFY、遼寧的菌株SY、安徽的菌株AH菌核形成時間緩慢，數(shù)量明顯少于其他菌株，說明不同地理來源的菌株具有一定的差異。

圖1 不同來源的病原菌菌落形態(tài)Fig.1 The colony morphology of strains isolated from different area

對分離自16個不同地理來源的61株病原菌菌株生長速率進(jìn)行測定，結(jié)果表明大多數(shù)菌株生長過程比較規(guī)律，平均生長速率基本一致，為0.21～0.23 cm·h-1。在生長早期，GD菌株生長較慢，生長速率僅為0.19 cm·h-1，但10 h后菌絲生長加快，達(dá)到0.33 cm·h-1，其菌絲生長最快，平均速率為0.24 cm·h-1。而HN和CC菌株生長相對較慢，平均生長速率分別為0.17和0.18 cm·h-1。

2.2.3病原菌菌絲形態(tài) 細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色、熒光顯微鏡成像觀察菌絲及細(xì)胞核形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離自16個不同地區(qū)的61個菌株細(xì)胞核在DAPI染色下均能清晰可見，基本無重合；菌絲多分枝，分枝處菌絲之間近直角或銳角，分枝處有溢縮，且分枝處多隔膜，隔膜將菌絲分成若干個單細(xì)胞，大多數(shù)細(xì)胞是多核的(圖2)。每個菌株計數(shù)約200個單細(xì)胞，對61株病原菌菌株細(xì)胞核的數(shù)量統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)(表2)，大多數(shù)菌株的細(xì)胞核集中在6～8個，HB、GD、和AH菌株的細(xì)胞核數(shù)量偏多。但GD菌株均勻分布在菌絲的各個部位(圖2a)，而AH菌株的細(xì)胞核主要集聚在一起(圖2d)，菌絲分枝均較多。而CC菌株的細(xì)胞核明顯偏少，菌絲分枝少(圖2c)，這可能與菌株生長的環(huán)境及地理?xiàng)l件有一定的關(guān)系。此外，菌絲與菌絲之間常發(fā)生融合現(xiàn)象(圖2b)，這可能是菌絲細(xì)胞形成多核的原因之一。

圖2 菌絲細(xì)胞核DAPI染色觀察Fig.2 Karyological observation of secondary mycelium with DAPI a, c, d：菌絲被隔膜分為多細(xì)胞菌絲(箭頭)及每個細(xì)胞的細(xì)胞核數(shù)；b：菌絲的融合。a, c, d：The hyphae were separated into multicellular mycelia by septum (arrows), and nuclear number in per cell；b：Hyphal fusion (arrows). 標(biāo)尺Bars: 20 μm.

菌株編號Strain ID細(xì)胞核數(shù)量Number of cell nucleus菌株編號Strain ID細(xì)胞核數(shù)量Number of cell nucleusGD4～14,大多數(shù)Most 7～10FM3～10,大多數(shù)Most 6～7GX5～12,大多數(shù)Most 6～8HN3～10,大多數(shù)Most 5～7ZZYY4～11,大多數(shù)Most 5～7WC4～9,大多數(shù)Most 6～8CQ4～14,大多數(shù)Most 6～9WJ4～14,大多數(shù)Most 6～8FJ4～13,大多數(shù)Most 6～7CC3～9,大多數(shù)Most 4～6NJ5～14,大多數(shù)Most 6～8HZFY4～12,大多數(shù)Most 6～8GZ5～13,大多數(shù)Most 7～8SY3～8,大多數(shù)Most 4～5HB5～19,大多數(shù)Most 7～10AH4～18,大多數(shù)Most 8～12

2.3 病原菌分子鑒定

以ITS序列引物對分離得到的61株病原菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測得到大小均為750 bp左右的條帶(圖3)，擴(kuò)增產(chǎn)物回收后進(jìn)行克隆，對單克隆的菌液進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在NCBI上使用nucleotide blast工具分析比對，結(jié)果顯示該61株菌株與RhizoctoniasolaniKX674518的同源性達(dá)到100%。利用MEGA 6軟件對立枯絲核菌不同融合群及分離菌株ITS序列進(jìn)行聚類分析，繪制分析系統(tǒng)樹，結(jié)果顯示所分離得到的菌株均與RhizoctoniasolaniAG1IA聚為一類(圖4)，表明分離到的61株菌株均是Rhizoctoniasolani,且屬于AG1IA融合群。

2.4 病原菌致病性測定

圖3 紋枯病分離菌株ITS-PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.3 PCR amplification of the ITS sequence of R. solani isolates M:DNA marker.

圖4 對立枯絲核菌不同融合群及分離菌株ITS序列的聚類分析Fig.4 Clustering analysis of ITS sequence of different R. solani isolate strains

通過離體水稻葉片接種GD、GX、ZZYY、CQ、FJ、NJ、GZ、HB、FM、HN、WC、WJ、CC、HZFY、SY和AH 16株病原菌進(jìn)行致病性測定，結(jié)果表明16株病原菌均能引起水稻葉片發(fā)病，且引起的癥狀特點(diǎn)基本一致，均產(chǎn)生云紋狀病斑紋枯病典型癥狀。采用水瓊脂分離法從發(fā)病葉片中再次分離病原菌，經(jīng)鑒定與原接種物一致。

對不同地理來源的16株病原菌菌株致病性進(jìn)行了測定，接種24 h后病原菌菌絲在葉片上大量蔓延伸展，接種菌株GX、FJ、NJ的葉片首先出現(xiàn)較小的褐色病斑；48 h后接種大部分菌株的葉片均開始產(chǎn)生水紋狀病斑，GD菌株產(chǎn)生3個左右病斑，較其他的菌株多，菌株GX最先形成云紋狀的大病斑，病斑中間部位呈灰白色，邊緣呈棕褐色，病斑已延伸至菌絲塊周圍2 cm處，菌株FJ、HZFY、NJ、CQ、ZZYY、WJ、GZ、FM、CC、HB、WC和HN也開始產(chǎn)生1～2個較小的邊緣清晰可見的病斑，而菌株SY、AH未產(chǎn)生病斑；72 h后接種菌株SY、AH的葉片開始產(chǎn)生第一個病斑，大部分菌株產(chǎn)生的病斑開始增多且在葉片上擴(kuò)散，比較而言，菌株HZFY產(chǎn)生的病斑少且小，只分布在菌絲塊周邊，沒有擴(kuò)散；接種侵染96 h后對不同菌株侵染的葉片病斑大小及占葉面積的百分比進(jìn)行統(tǒng)計(圖5)，結(jié)果表明菌株GD、GX侵染的葉片病斑大，病斑顏色較深，病斑遍布大半張葉片，導(dǎo)致葉片從接種點(diǎn)至葉尖局部變?yōu)辄S色，致病力較強(qiáng)，而CC、WC、WJ、AH、SY、HZFY菌株侵染產(chǎn)生的病斑較小，多集中在接種點(diǎn)周圍，零星分布，沒有擴(kuò)散至整個葉片，葉片沒有變黃的跡象，致病力相對較弱。

圖5 不同菌株感染水稻葉片96 h后發(fā)病情況Fig.5 The pathogenicity comparison of different strains infecting the rice leaves for 96 hours later

3 討論

本研究首次從我國各水稻種植區(qū)采集分離水稻紋枯病病原菌。研究了不同地理來源的紋枯病病原菌在人工培養(yǎng)基上的菌絲生長差異及菌落形態(tài)變化。結(jié)果表明，生長后期產(chǎn)生的褐色菌核結(jié)構(gòu)是其典型菌落特征。大部分菌株之間平均生長速率差異不大，部分菌株具有一定的差異。形成的菌核分為大且圓，菌核之間不相連和集中在接種點(diǎn)周圍兩種類型。

Flentje等[17]曾報道過R.solani核的分布情況，且真菌細(xì)胞核數(shù)量變化也可以作為菌種的分類標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)用熒光染料DAPI染色紋枯病病原菌菌絲，對其細(xì)胞核進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明菌絲體細(xì)胞為多核，不同地理來源的菌株細(xì)胞核數(shù)量具有明顯差異，來源于黑龍江、遼寧、吉林等地的菌株細(xì)胞核數(shù)量較其他地區(qū)少，可能由于北方的地理環(huán)境，使得菌絲生長適宜條件的持續(xù)時間少，菌絲進(jìn)化的速度慢于高溫高濕地區(qū)的菌株。

ITS是真菌核糖體DNA 18S和28S基因之間的序列片段[18]，能鑒定真菌屬、種之間的堿基差異[19]。陳雨等[20]利用ITS序列分析對田間早期不顯癥的水稻稻粒黑粉病樣本進(jìn)行發(fā)病監(jiān)測，可提早預(yù)知該病的發(fā)生，并進(jìn)行合理的防控，減輕病害損失。本試驗(yàn)利用ITS序列分析對分離到的61株病原菌菌株進(jìn)行了融合群測定，結(jié)果表明61株菌株均與RhizoctoniasolaniAG1IA聚為一類，說明分離到的61株菌株均屬于AG1IA融合群，這與Kuninaga等[21]和李華榮[22]的研究結(jié)果一致。也有報道從水稻上分離到了AG1IB、AG1IC融合群菌株，但以水稻為寄主的主要是AG1IA融合群。

使用分離到的病原菌菌株回接試驗(yàn)表明，不同地理來源的病原菌菌株均侵染水稻葉片，并產(chǎn)生云紋狀病斑的紋枯病癥狀，進(jìn)一步從柯赫氏法則的角度對分離菌株進(jìn)行了鑒定[23]。分離自不同地區(qū)的紋枯病病原菌致病力不同，其中來源于廣東、廣西、福建、重慶等地的菌株致病力較強(qiáng)，而黑龍江、吉林、遼寧等地區(qū)的菌株致病力較弱，由于紋枯病在高溫高濕條件下發(fā)病較重，而南方稻區(qū)高溫高濕的環(huán)境條件正好為病原菌的侵染循環(huán)提供了良好的媒介，因此不同地理來源的菌株其致病力有明顯差異，這與周而勛等[24]的研究相一致，說明在不同的生態(tài)環(huán)境下，同一菌群的菌株間由于受地理環(huán)境影響，可能出現(xiàn)較大的遺傳差異，而這些遺傳差異可能是導(dǎo)致其致病力不同的原因。

致病力較強(qiáng)的廣東、廣西等地菌株最先開始形成褐色菌核，在后期生長過程中菌核大且完整，菌核間不相連，使用菌核接種時，萌發(fā)時間短，菌絲生長速度較快，而對于致病力較弱的遼寧、安徽、浙江等地菌株不僅形成菌核時間晚，而且最終形成的菌核小、數(shù)量少。表明病原菌致病力與其菌核數(shù)量及結(jié)構(gòu)相關(guān)，這與鄒成佳等[25]對華南三省區(qū)水稻紋枯病菌致病力測定所得的結(jié)論不同，他們認(rèn)為菌核數(shù)量與其致病力之間沒有直接聯(lián)系，但作為重要侵染源，菌核數(shù)量的多少也是影響病害發(fā)生的一個重要因素，這可能是由于病原菌分布的地域較近，菌核數(shù)量和形態(tài)差異不大。對不同地理來源立枯絲核菌致病力的測定、細(xì)胞核及生長狀況的觀察，有助于了解同一種屬不同分離菌的生物學(xué)差異，進(jìn)一步揭示立枯絲核菌的演化歷史、進(jìn)化機(jī)制以及適應(yīng)環(huán)境等問題，以期從遺傳背景上找到病原菌致病力分化的原因，為防控該病害提供新的策略。