師茜，田沛，南志標(biāo)

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

禾草內(nèi)生真菌(grass endophyte fungi)是指在禾草中度過(guò)全部或大部分生命周期，而禾草不顯示外部癥狀的一大類真菌[1-2]，屬麥角菌科(Clavicipitaceae)香柱菌屬(Epichlo?)[3-5]。其無(wú)性型多存在于禾本亞科(Pooideae)的冷季型牧草中，通過(guò)種子進(jìn)行垂直傳播。在頻繁刈割、踐踏和采食的情況下，無(wú)性型內(nèi)生真菌也會(huì)發(fā)生水平傳播。有性型內(nèi)生真菌則通過(guò)產(chǎn)生子座在宿主間進(jìn)行水平傳播。大量的研究表明，存在于我國(guó)的禾草內(nèi)生真菌均為無(wú)性型Epichlo?內(nèi)生真菌[6-9]。Leuchtmann 等[10]根據(jù)內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育和形態(tài)特征，依據(jù) “一種真菌一個(gè)名稱”的命名原則，將已發(fā)表鑒定的18種有性世代(Epichlo?)和25種無(wú)性世代(Neotyphodium)內(nèi)生真菌均劃分為Epichlo? 屬內(nèi)生真菌，原本Neotyphodium屬認(rèn)為暫時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)其有性世代，也被冠以Epichlo?屬[6,11]。

1977年，Bacon等[12]從高羊茅(Festucaarundinacea)中分離得到內(nèi)生真菌。19世紀(jì)80年代初，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)與多年生黑麥草(Loliumperenne)共生的內(nèi)生真菌(Epichlo?festucaevar.lolii)有益于宿主植物的生長(zhǎng)后[13]，內(nèi)生真菌成為牧草及草坪草研究的重要組成部分。大量的研究證明，內(nèi)生真菌可提高禾草的耐旱性[14]、耐鹽性[15]、耐寒性[16]、抗病性[17]，并能夠促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、提高牧草產(chǎn)量[18-19]。大部分內(nèi)生真菌在宿主體內(nèi)產(chǎn)生生物堿，目前為止，內(nèi)生真菌與禾草共生時(shí)產(chǎn)生的生物堿主要有吲哚雙萜類(indole diterpenes)，麥角堿(ergot alkaloids)，波胺(peramine)和黑麥草堿(lolines)，除peramine外的其余3類生物堿均對(duì)哺乳動(dòng)物有毒，其中毒性較強(qiáng)的是lolitrem B和ergovaline，分別是引致狐茅中毒癥和黑麥草蹣跚病的主要原因，給畜牧業(yè)帶來(lái)了巨大損失[11,20-24]。因此，禾草內(nèi)生真菌的雙重特性引起了許多國(guó)際學(xué)者的興趣，成為國(guó)際研究熱點(diǎn)之一[2]。我國(guó)對(duì)禾草內(nèi)生真菌的研究始于20世紀(jì)。1996年，南志標(biāo)團(tuán)隊(duì)率先對(duì)禾草內(nèi)生真菌進(jìn)行了初步研究，在《草業(yè)學(xué)報(bào)》和《草業(yè)科學(xué)》刊物上共發(fā)表研究論文3篇[25-27]，這引起了國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)禾草內(nèi)生真菌研究領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。為了使禾草內(nèi)生真菌更好地造福人類，近20多年來(lái)，我國(guó)科研工作者立足我國(guó)禾草資源，在禾草內(nèi)生真菌領(lǐng)域展開了大量的研究并發(fā)表了一系列的論文。

通過(guò)對(duì)特定主題文獻(xiàn)數(shù)量的統(tǒng)計(jì)，有助于了解其科學(xué)發(fā)展的狀況。目前與禾草內(nèi)生真菌研究的相關(guān)論文的系統(tǒng)分析尚未見報(bào)道。因此，本研究從文獻(xiàn)信息學(xué)的角度，以禾草內(nèi)生真菌為主題，采用文獻(xiàn)計(jì)量方法，對(duì)1996-2016年間美國(guó)Web of Science數(shù)據(jù)庫(kù)中，我國(guó)科研人員發(fā)表的禾草內(nèi)生真菌文獻(xiàn)進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)和分析，揭示我國(guó)科研工作者在該領(lǐng)域的研究動(dòng)態(tài)。這有助于掌握禾草內(nèi)生真菌研究的最新發(fā)展動(dòng)態(tài)，為我國(guó)禾草內(nèi)生真菌學(xué)后續(xù)的發(fā)展提供文獻(xiàn)參考。

1 文獻(xiàn)獲取及數(shù)據(jù)分析方法

采用大型綜合性、多學(xué)科引文索引的美國(guó)科學(xué)信息研究所(ISI)Web of Knowledge的Web of Science數(shù)據(jù)庫(kù)，選用普通檢索方式，以“Epichlo?”或“Neotyphodium”為關(guān)鍵詞，在該數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)檢索1996-2016年間相關(guān)文獻(xiàn)題錄數(shù)據(jù)。手動(dòng)排除與本研究主題不符、內(nèi)容無(wú)關(guān)的文獻(xiàn)，篩選得到與禾草內(nèi)生真菌相關(guān)的研究文獻(xiàn)共計(jì)1042篇(包括港、澳、臺(tái)地區(qū))。統(tǒng)計(jì)文獻(xiàn)的年份、數(shù)量、影響因子、H指數(shù)、發(fā)表期刊、主要科研機(jī)構(gòu)、研究方向等信息，對(duì)論文發(fā)文量、發(fā)表期刊、論文影響因子的分布、研究機(jī)構(gòu)、主要研究領(lǐng)域以及高倍引用論文進(jìn)行分析。其中，影響因子是指某年引用某期刊前兩年論文的總次數(shù)與前兩年該期刊發(fā)表的論文總數(shù)的比值，它是國(guó)際上通行的期刊評(píng)價(jià)指標(biāo)[28]。H指數(shù)是指一個(gè)國(guó)家(或機(jī)構(gòu)、科研人員)最多有H篇論文分別被引用了最少H次，該值越高，表明它的論文影響力越大[29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 全球發(fā)文趨勢(shì)及國(guó)家分析

1996-2016年間，Web of Science 數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的禾草內(nèi)生真菌研究相關(guān)論文共計(jì)1042篇，發(fā)文國(guó)家共31個(gè)。之后，選取發(fā)文量排名前10名的國(guó)家進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表1)。美國(guó)、新西蘭的發(fā)文量和H指數(shù)(high citiations)領(lǐng)先于其他國(guó)家，瑞士的平均被引次數(shù)最高，因此國(guó)際上對(duì)于禾草內(nèi)生真菌研究的主要力量分布在美國(guó)、新西蘭和瑞士這3個(gè)國(guó)家。雖然我國(guó)禾草內(nèi)生真菌研究相對(duì)于美國(guó)、新西蘭、瑞士、阿根廷、澳大利亞、日本等國(guó)家起步較晚，但是到2016年，我國(guó)禾草內(nèi)生真菌研究發(fā)文量已迅速超越許多國(guó)家，國(guó)際排名躍居第4。

選取發(fā)文量前5位的國(guó)家，按發(fā)表年份匯總(圖1)。1996-2016年之間，美國(guó)、新西蘭、阿根廷、瑞士、中國(guó)5個(gè)國(guó)家的年發(fā)文數(shù)量雖然波動(dòng)較大，但整體呈緩慢上升的變化趨勢(shì)。我國(guó)對(duì)禾草內(nèi)生真菌研究的首篇論文是在1998年由清華大學(xué)學(xué)者Ju等[30]在Journal of Agriculture and Food Chemistry上發(fā)表的題為“Bioactive flavonoids from endophyte-infected blue grass (Poaampla)”的文章，該文對(duì)感染和不感染Neotyphodium內(nèi)生真菌的巨早熟禾(Poaampla)不同部位的乙醇、乙酸乙酯、正己烷提取物的殺蟲活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)感染Neotyphodium內(nèi)生真菌的巨早熟禾具有抗蚊子幼蟲的活性，然而未對(duì)其攜帶的內(nèi)生真菌及其他生理及生化方面進(jìn)行研究，跟蹤檢索發(fā)現(xiàn)該作者后來(lái)也并未發(fā)表內(nèi)生真菌相關(guān)文獻(xiàn)。因此，嚴(yán)格意義上講這并不能算中國(guó)對(duì)禾草內(nèi)生真菌方面研究的初始元年。2004年后，自蘭州大學(xué)南志標(biāo)院士團(tuán)隊(duì)從醉馬草(Achnatheruminebrians)中分離得到甘肅內(nèi)生真菌并正式命名為：Epichlo?gansuensisSchardl, comb. nov.[10,31]開始之后,國(guó)內(nèi)科研工作者逐步展開對(duì)禾草內(nèi)生真菌的研究[5]。

表1 1996-2016年間，發(fā)表禾草內(nèi)生真菌發(fā)文總量居前10的國(guó)家Table 1 Top 10 countries of publishing article on grass endophyte fungi during 1996-2016

2.2 1996-2016年間我國(guó)發(fā)表禾草內(nèi)生真菌文獻(xiàn)期刊分布

圖1 1996-2016年間，總發(fā)文量前五的國(guó)家年發(fā)文情況分析Fig.1 The dynamic of top 5 countries publishing articles on grass endophytic fungi during 1996 to 2015

表2列出了收錄我國(guó)禾草內(nèi)生真菌研究論文數(shù)量排名前15的期刊。我國(guó)的66篇論文發(fā)表于42個(gè)期刊，其中有25個(gè)期刊分別各收錄1篇，F(xiàn)ungal Ecology，Mycologia和Symbiosis是刊登我國(guó)禾草內(nèi)生真菌論文的三大主要期刊(表2)。發(fā)表在影響因子小于1，介于1～2、2～3、3～4、4～5，大于5的期刊論文數(shù)量分別占7.75%、24.24%、46.97%、12.12%、4.54%、4.54%(圖2)。2007年，由南開大學(xué)高玉葆教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表在Fungal Diversity(IF2016=13.465)期刊的題為“Distribution and diversity ofEpichlo?/Neotyphodiumfungal endophyte from different populations ofAchnatherumsibiricum(Poaceae) in the Inner Mongolia Steppe, China”的論文[32]，是目前我國(guó)學(xué)者以第一作者身份在禾草內(nèi)生真菌領(lǐng)域中發(fā)表的影響因子最高的論文。隨著我國(guó)禾草內(nèi)生真菌研究的深入，不斷有論文發(fā)表于Plant and Soil (IF2016=3.052，農(nóng)林1區(qū))[15]、Journal of Agricultural and Food Chemistry (IF2016=3.154，農(nóng)林1區(qū))[33]、Scientific Reports(IF2016=4.259，綜合2區(qū))[34]等高水平期刊。

表2 刊登我國(guó)禾草內(nèi)生真菌研究最多的15種期刊Table 2 Top 15 journals of publishing articles on grass endophyte fungi during 1996 to 2016

2.3 關(guān)鍵詞分析

圖2 1966-2016年我國(guó)禾草內(nèi)生真菌論文影響因子分布Fig.2 Distribution of impact factors of the articles on grass endophyte fungi published by Chinese scientists during 1996 to 2016

關(guān)鍵詞是對(duì)論文的研究?jī)?nèi)容、方法、對(duì)象等的高度概括，從關(guān)鍵詞的分布可以看出相應(yīng)研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)、創(chuàng)新及發(fā)展趨勢(shì)。表3列出了66篇論文中出現(xiàn)頻次排名前10的關(guān)鍵詞共計(jì)10個(gè)。通過(guò)關(guān)鍵詞分析可知，醉馬草(Achnatheruminebrians)和羽茅(Achnatherumsibiricum)為主要研究對(duì)象，禾草內(nèi)生真菌資源挖掘，產(chǎn)堿特性以及其對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的作用，內(nèi)生真菌提高宿主植物抗旱性、抗寒性、抗鹽性的生理生化機(jī)制研究是我國(guó)禾草內(nèi)生真菌主要的研究熱點(diǎn)。

1)我國(guó)有著豐富的禾草資源，超過(guò)77種禾草被認(rèn)為攜帶有Epichlo?內(nèi)生真菌，已知帶菌的禾草存在于芨芨草屬(Achnatherum)、冰草屬(Agropyron)、剪股穎屬(Agrostis)、短柄草屬(Brachypodium)、雀麥屬(Bromus)、拂子茅屬(Calamagrostis)、隱子草屬(Cleistogenes)、鴨茅屬(Dactylis)、發(fā)草屬(Descampsia)、披堿草屬(Elymus)、偃麥草屬(Elytrigia)、畫眉草屬(Eragrostis)、羊茅屬(Festuca)、大麥屬(Hordeum)、賴草屬(Leymus)、臭草屬(Melica)、溚草屬(Koeleria)、早熟禾屬(Poa)、鵝觀草屬(Roegneria)、針茅屬(Stipa)[2,6]。目前為止已從我國(guó)禾草中分離鑒定的內(nèi)生真菌有9種，其中7種為新種[6]。禾草內(nèi)生真菌資源的挖掘，有助于整體認(rèn)識(shí)和理解內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程以及優(yōu)良禾草的選育和改良。2)禾草內(nèi)生真菌共生體產(chǎn)生的生物堿可在宿主體內(nèi)積累，幫助其防御捕食者，進(jìn)而對(duì)上一級(jí)營(yíng)養(yǎng)層甚至生態(tài)系統(tǒng)中多級(jí)營(yíng)養(yǎng)層產(chǎn)生影響。此外，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)家畜具有毒害作用的醉馬草-內(nèi)生真菌共生體有利于維護(hù)草原植物和節(jié)肢動(dòng)物的多樣性，為草原生態(tài)系統(tǒng)的建立提供了新視野[35]。3)干旱是影響植物生存、生長(zhǎng)和分布的最重要的非生物脅迫之一。內(nèi)生真菌能夠提高共生體的耐旱性主要是在干旱條件下寄主植物經(jīng)過(guò)一系列形態(tài)和生理的適應(yīng)和調(diào)整來(lái)適應(yīng)環(huán)境，這些適應(yīng)和調(diào)整使寄主植物能及早避免水分丟失，增強(qiáng)對(duì)干旱的抵抗力和提高干旱結(jié)束后的恢復(fù)力[2,35]。我國(guó)對(duì)禾草內(nèi)生真菌提高宿主抗非生物與非生物脅迫的生理生化機(jī)制也進(jìn)行了大量的研究[15,36-42]，這有利于進(jìn)一步深入理解禾草與內(nèi)生真菌的共生關(guān)系。

表3 出現(xiàn)頻次排名前10 的關(guān)鍵詞Table 3 The frequency of the key words published in top 10

2.4 論文被引情況分析

我國(guó)禾草內(nèi)生真菌研究領(lǐng)域被引次數(shù)最高的前 10篇論文見表4。 從10篇高被引用論文研究?jī)?nèi)容來(lái)看，禾草內(nèi)生真菌新種的發(fā)現(xiàn)、對(duì)生物脅迫與非生物脅迫的抗性以及生物堿類次生代謝產(chǎn)物研究的關(guān)注度最高。分子生物學(xué)相關(guān)的研究論文占2篇，均側(cè)重于對(duì)生物堿合成基因的分析，其中一篇的被引次數(shù)達(dá)116，而另一篇被引次數(shù)為34?？梢姺肿由飳W(xué)為禾草內(nèi)生真菌的研究提供了新技術(shù)、新方法，禾草內(nèi)生真菌在分子生物學(xué)方面的研究已成為當(dāng)前該研究領(lǐng)域的活躍部分。而關(guān)于新種的挖掘、內(nèi)生真菌與宿主的互作的論文也有較高的引用率。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)、代謝組學(xué)、生物信息學(xué)的快速發(fā)展以及在植物和真菌學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的廣泛應(yīng)用，世界禾草內(nèi)生真菌的研究方向主要集中在內(nèi)生真菌與寄主相互作用的分子機(jī)制以及利用內(nèi)生真菌進(jìn)行牧草和草坪草育種等方面[11]。相應(yīng)地，我國(guó)也積極開展了對(duì)禾草內(nèi)生真菌在分子方面的研究，代表性工作有：利用特定DNA片段如tubB、tefA序列研究?jī)?nèi)生真菌以及相關(guān)宿主進(jìn)行遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育、起源和進(jìn)化[43-45]；對(duì)內(nèi)生真菌提高醉馬草種子萌發(fā)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行分析[45]，均取得了一定的研究成果。

表4 1996-2016年，禾草內(nèi)生真菌研究前10篇高被引論文Table 4 Top 10 most cited articles in the field of grass endophyte fungi during 1996 to 2016

3 討論

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)、代謝組學(xué)、生物信息學(xué)的快速發(fā)展以及在植物和真菌學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的廣泛應(yīng)用，國(guó)際禾草內(nèi)生真菌的研究主要集中在內(nèi)生真菌與寄主相互作用的分子機(jī)制以及利用內(nèi)生真菌進(jìn)行牧草和草坪草育種等方面[11]，例如：基于基因敲除技術(shù)開展的單個(gè)目標(biāo)基因的研究，闡釋了維持內(nèi)生真菌與宿主動(dòng)態(tài)平衡的分子機(jī)制[44-45]；對(duì)peramine、ergot和loline生物堿的生物合成途徑、調(diào)控基因以及其所編碼的酶已有了深入研究，明確了次生代謝物多樣性與基因的關(guān)系[27,48]；利用基因組學(xué)等技術(shù)篩選對(duì)家畜無(wú)毒的內(nèi)生真菌菌株，通過(guò)接種技術(shù)建立新的既具有抗逆，又對(duì)家畜無(wú)毒的禾草-內(nèi)生真菌共生體，提高禾草品質(zhì)并確保對(duì)動(dòng)物的安全性[48-49]。

雖然我國(guó)禾草內(nèi)生真菌已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但是與美國(guó)、新西蘭等國(guó)家還存在一定的差距。由文獻(xiàn)計(jì)量分析發(fā)現(xiàn)，未來(lái)我國(guó)禾草內(nèi)生真菌研究可能在以下方面具有較大發(fā)展?jié)摿Γ?)禾草內(nèi)生真菌的分類地位評(píng)價(jià)。目前為止，已從我國(guó)禾草中分離鑒定的內(nèi)生真菌有9種，其中7種為新種，但一部分內(nèi)生真菌未鑒定至種的水平；2)禾草內(nèi)生真菌遺傳進(jìn)化、功能基因、比較基因組方面的研究。我國(guó)對(duì)內(nèi)生真菌提高宿主禾草抗生物與非生物脅迫、產(chǎn)生物堿進(jìn)行了大量的研究，但是在遺傳進(jìn)化、功能基因、比較基因組方面的研究較少；3)生物農(nóng)藥資源開發(fā)和利用。Song等[33]已從披堿草內(nèi)生真菌中分離純化出具有類似除草劑活性生物化合物，對(duì)多年生黑麥草和早熟禾幼苗生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。內(nèi)生真菌是豐富的天然產(chǎn)物資源庫(kù)，孕育著多種新型化合物，利用這些新型化合物創(chuàng)制出更有效、環(huán)保的殺蟲劑、殺菌劑、除草劑等生物農(nóng)藥，具有廣闊的應(yīng)用前景。

此外，我國(guó)需加強(qiáng)在禾草內(nèi)生真菌領(lǐng)域的投入。包括人才的培養(yǎng)和引進(jìn)，國(guó)際合作與交流，以及增加科研所需的各種軟硬件投入。不斷提升禾草內(nèi)生真菌領(lǐng)域的科研水平，推動(dòng)我國(guó)禾草內(nèi)生真菌研究事業(yè)的發(fā)展，縮短與其他國(guó)家的差距，進(jìn)一步提升我國(guó)在禾草內(nèi)生真菌研究領(lǐng)域的國(guó)際影響力，積極發(fā)揮禾草內(nèi)生真菌對(duì)農(nóng)業(yè)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境可持續(xù)應(yīng)有的貢獻(xiàn)和價(jià)值。積極推動(dòng)草地農(nóng)業(yè)智庫(kù)系統(tǒng)的構(gòu)建，深入研究禾草內(nèi)生真菌在草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的作用，助力中國(guó)農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)型[50]。