趙嘉梅， 張愛華，黃紫微,王希浩

1.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院婦科(鄭州 450000)，2.南京中醫(yī)藥大學(xué)(南京210023)

主題詞 不育, 女性/中醫(yī)藥療法 @疏肝補(bǔ)腎 動物實(shí)驗(yàn) 小鼠

我國女性從事社會活動、工作的比例不斷上升，隨著全社會經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，我國居民生活、工作節(jié)奏日益加快[1-3]。長期慢性應(yīng)激狀態(tài)使部分女性在生理、心理等多重慢性刺激作用下發(fā)生了不同程度的排卵功能障礙、黃體功能異常、子宮內(nèi)膜容受性(Endometrial receptivity，ER)受損等生理病變[4-6]。從而對妊娠需求、生理健康以及心理等形成了不良影響。西醫(yī)西藥為對癥治療模式，對于慢性刺激所至的子宮內(nèi)膜容受性降低而形成的相關(guān)疾病尚無特效療法。中醫(yī)理論認(rèn)為本病屬于“肝郁證”的范疇。為了深入研究中醫(yī)疏肝補(bǔ)腎中藥對于慢性應(yīng)激性子宮內(nèi)膜容受性減低而誘發(fā)的不孕癥，我們選取疏肝補(bǔ)腎經(jīng)典方藥，開展本次動物建模實(shí)驗(yàn),現(xiàn)將詳細(xì)研究內(nèi)容與結(jié)果總結(jié)于后文。

資料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動物 自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心購進(jìn)SPF級的KM雄性小鼠50只，日齡為28～32 d；SPF級的KM雌性小鼠80只，日齡為21～28 d,許可證號：SCK(豫)2015-0002，合格證號：No.41003100002729。

2 實(shí)驗(yàn)用藥 逍遙丸(國藥準(zhǔn)字Z41021831)，配制為濃度0.3 g/ml的混懸液備用；滋腎育胎丸(國藥準(zhǔn)字Z44020008)，配制為濃度0.3 g/ml的混懸液備用。疏肝補(bǔ)腎中藥，方劑組成：菟絲子、仙靈脾、肉蓯蓉各30 g，熟地20 g，山萸肉、枸杞子、當(dāng)歸、生白芍、制香附各15 g，柴胡、鹿角霜、制龜版、炒白術(shù)各12 g，雞內(nèi)金9 g；孕后方，方劑組成：黃芪、熟地、菟絲子各30 g，生白芍、黨參、炒白術(shù)、枸杞子各15 g，川斷、杜仲、桑寄生各12 g，柴胡、紫蘇梗、黃芩各9 g，砂仁6 g；以上藥材生藥按原方劑量20倍取材制劑，制成1.21 g/ml流浸膏備用。上述中藥材均購自同仁堂中藥飲片有限公司。

3 建模與分組方法 自全部雌鼠中隨機(jī)選取20只歸入空白組，其余60只制備為慢性應(yīng)激小鼠模型?？瞻捉M選取15只精神狀態(tài)良好的雌鼠進(jìn)入下一階段實(shí)驗(yàn)；自60只慢性應(yīng)激小鼠模型中選取45只建模最為成功的隨機(jī)均分為模型組、陽性對照組與中藥觀察組進(jìn)入下一階段實(shí)驗(yàn)。

慢性應(yīng)激小鼠模型依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)方法制備[7]。對60只雌性小鼠給予慢性刺激持續(xù)21 d，刺激操作包括：15 min起動～300次/min振幅為20 MM的水平震蕩、24 h禁水、24 h禁食、以150 ml純凈水注入籠底墊料使墊料保持濕潤24 h、束縛3 h、10 MA的10 S/次足底電刺激間隔30 s連續(xù)20次、24 h晝夜顛倒、有威脅性的陌生氣味、40DB的10 S/次噪音刺激間隔30 s連續(xù)20次等刺激，每天隨機(jī)進(jìn)行一種刺激，每種刺激重復(fù)3次。刺激結(jié)束后，對60只小鼠進(jìn)行曠場試驗(yàn)、懸尾試驗(yàn)、稱量體重；曠場試驗(yàn)，記錄小鼠在3 min內(nèi)完成的水平穿格數(shù)、在中央格的停留時間、直立的次數(shù)、修飾的次數(shù)、糞粒數(shù)；懸尾實(shí)驗(yàn)，固定小鼠尾部，使其在三面封閉環(huán)境下倒置懸掛6 min，記錄倒懸后4 min內(nèi)的靜止時間；通過統(tǒng)計上述數(shù)據(jù)進(jìn)行分析確定建模成功。

4 實(shí)驗(yàn)方法 空白組15只小鼠持續(xù)常規(guī)喂養(yǎng)，正常飲食、休息、活動，保持健康，不予任何藥物干預(yù)，持續(xù)21 d后合籠，至見栓后第5天。模型組15只小鼠于建模成功后持續(xù)常規(guī)喂養(yǎng)，喂養(yǎng)方法與空白組相同，不予任何藥物干預(yù)，持續(xù)21 d后合籠，至見栓后第5天。觀察組于建模成功后給予疏肝補(bǔ)腎中藥流浸膏，按1 ml/100 g(體重)灌胃，持續(xù)21 d后合籠，合籠后給予孕后方按1 ml/100 g(體重)灌胃至見栓后第5天。陽性對照組于建模成功后給予逍遙丸混懸液，按1 ml/100g灌胃，持續(xù)21 d后合籠，合籠后給予滋腎育胎丸混懸液按1 ml/100 g(體重)灌胃至見栓后第5天。

5 觀察指標(biāo)與方法 觀察組各組小鼠建模后21 d時的體重及行為學(xué)指標(biāo)：中央格停留時間、水平穿格數(shù)、直立次數(shù)、懸尾靜止時間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后統(tǒng)計見栓率與著床數(shù)以及子宮內(nèi)膜VEGF、LIF的表達(dá)水平。

各組小鼠均于建模后21 d晚按1∶1比例與雄性小鼠合籠，見陰栓日記為妊娠第1 d，未見陰栓的連續(xù)合籠5天至見到陰栓為止。于妊娠第5 d晨，以后頸椎脫臼法將各組小鼠處死，解剖后統(tǒng)計著床數(shù)并取子宮內(nèi)膜，制作石蠟切片以免疫組化法于高倍電子顯微鏡下觀察VEGF、LIF在子宮內(nèi)膜的表達(dá)水平。

6 統(tǒng)計學(xué)方法 全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均錄入至SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量數(shù)據(jù)以Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)分布狀態(tài)，以單因素方差分析(One-Way ANOVA)檢驗(yàn)差異性，進(jìn)一步兩兩對比采取LSD-L分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以Mean±SD表述，偏態(tài)分布數(shù)據(jù)以M×25%～×75%)表述；計數(shù)數(shù)據(jù)以卡方檢驗(yàn)；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組行為學(xué)指標(biāo)比較 見表1。各組間中央格停留時間、水平穿格數(shù)、直立次數(shù)、懸尾靜止時間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)進(jìn)一步兩兩對比，各組間各項(xiàng)行為學(xué)指標(biāo)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2 各組見栓率與著床數(shù)比較 見表2。各組間見栓率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)一步對比觀察組與空白組、模型組與陽性對照組間見栓率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；其余各組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；觀察組胚胎著床數(shù)高于其它各組，各組間胚胎著床數(shù)兩兩對比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組間行為學(xué)指標(biāo)比較

注：與空白組對比，☆P<0.05；與模型組對比，★P<0.05；與陽性對照組對比，◇P<0.05

表2 各組見栓率與胚胎著床數(shù)比較

注：與空白組對比，☆P<0.05；與模型組對比，★P<0.05；與陽性對照組對比，◇P<0.05

3 各組子宮內(nèi)膜VEGF、LIF表達(dá)水平比較 見表4。各組子宮內(nèi)膜VEGF、LIF表達(dá)水平比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；進(jìn)一步兩兩對比，各組間子宮內(nèi)膜VEGF、LIF表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表4 各組間LIF、VEGF對比(光度值)

注：與空白組對比，☆P<0.05；與模型組對比，★P<0.05；與陽性對照組對比，◇P<0.05

討 論

在生活節(jié)奏日益加快、各種壓力逐漸增強(qiáng)的現(xiàn)代社會中，女性的社會活動日益頻繁，承擔(dān)的壓力也更加多元化。長期處于這種應(yīng)激狀態(tài)下，部分女性的生殖系統(tǒng)可發(fā)生不同程度的病理改變。在不孕癥的臨床上約有5%左右與精神應(yīng)激因素相關(guān)，而在不孕癥女性患者中約有50%以上的患者合并有不同程度的心理癥狀[8-10]。外界的刺激、不孕癥形成的心理壓力使患者的神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫功能以及生殖系統(tǒng)等發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)。部分患者逐步形成生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的慢性應(yīng)激性損害。因此，慢性應(yīng)激反應(yīng)已經(jīng)成為了生殖內(nèi)分泌系列疾病的一種主要誘因。臨床主要表現(xiàn)為月經(jīng)不調(diào)、婦科炎性疾病、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、不孕等諸多生殖障礙性病變，對患者的身心健康均構(gòu)成不良影響[11-13]?，F(xiàn)代西醫(yī)學(xué)認(rèn)為，心理應(yīng)激反應(yīng)可誘發(fā)下丘腦-垂體-腎上腺軸的功能亢進(jìn)，使腎上腺皮質(zhì)激素的分泌異常升高，抑制了β-內(nèi)啡肽、下丘腦多巴胺以及5-羥色胺等的合成，使血清中泌乳素的含量升高，從而對卵巢甾體激素的分泌合成形成干擾，最終形成了生殖功能障礙[14-15]。ER是子宮內(nèi)膜在正常月經(jīng)周期中的特定的一段極短時間內(nèi)允許胚胎侵入、黏附以及著床的開放功能，這一段極短時間為“著床期”、“窗口期”。胞飲突、同源框基因(Homeoboxgene，HOX)表達(dá)、局部激素分泌異常、細(xì)胞因子表達(dá)改變、免疫功能異常以及應(yīng)激反應(yīng)等均可對ER構(gòu)成影響。

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為情志異常而形成的生殖系統(tǒng)病變或功能障礙等均屬于“肝郁”、“情志失調(diào)”等范疇。中醫(yī)理論認(rèn)為本病蓋因肝郁不舒加之脾腎羸弱或后天失養(yǎng)，或有情志失調(diào)、飲食不節(jié)等而致的肝郁、腎虧、脾弱、血虛而形成本病。因此治療應(yīng)以疏肝補(bǔ)腎、養(yǎng)血益氣、健脾固中為主。我們以疏肝補(bǔ)腎中藥對慢性應(yīng)激小鼠進(jìn)行治療效果理想。疏肝補(bǔ)腎方中菟絲子潤養(yǎng)肝腎、生精益血、通調(diào)經(jīng)絡(luò)；柴胡、熟地、生白芍具有滋陰補(bǔ)血、疏肝健脾之功；柴胡入氣分、解郁疏肝、升陽；熟地溫潤柔肝，滋陰養(yǎng)血、益髓生精；白芍?jǐn)筷幑探?、柔肝養(yǎng)血；枸杞子平補(bǔ)精血、養(yǎng)腎柔肝；山萸肉溫養(yǎng)精氣、固澀榮血；當(dāng)歸行血、補(bǔ)血；鹿角膠補(bǔ)益精血、溫陽補(bǔ)腎、榮筋強(qiáng)骨；制龜版涼血補(bǔ)心、潤燥養(yǎng)陰；仙靈脾調(diào)理沖任，可發(fā)揮理氣疏肝、補(bǔ)腎養(yǎng)陰之功；制香附味辛、微苦，性平，入肝經(jīng)之氣分，可疏肝解郁，降逆泄火；鹿角霜溫補(bǔ)腎陽、止血固斂，主治脾腎陽虛、納差惡心、崩漏血瀝等癥；肉蓯蓉味甘、咸，可益腎補(bǔ)陽、潤腸通便，為補(bǔ)益陽精之要藥；白術(shù)健脾祛濕、補(bǔ)氣滋陰，利于水谷精微全身運(yùn)化生血之功；雞內(nèi)金味甘、性平，健胃補(bǔ)脾、消積化食，促進(jìn)諸藥吸收。諸藥共用可益氣健脾、補(bǔ)腎疏肝、滋陰養(yǎng)血、條達(dá)氣機(jī)、充盈氣血之功。

通過本次研究證明，通過疏肝補(bǔ)腎中藥治療21 d后，觀察組小鼠的各項(xiàng)行為學(xué)指標(biāo)優(yōu)于陽性對照組與模型組，但與空白組的健康小鼠仍有一定差距，提示21d治療周期尚無法使慢性應(yīng)激小鼠完全恢復(fù)至正常水平，通過延長治療有望達(dá)到正常標(biāo)準(zhǔn)。而陽性對照組小鼠的各項(xiàng)行為學(xué)指標(biāo)優(yōu)于模型組，說明逍遙丸能夠改善應(yīng)激小鼠的行為學(xué)指標(biāo)，但未能達(dá)到觀察組水平，提示疏肝補(bǔ)腎中藥對于改善應(yīng)激小鼠行為學(xué)指標(biāo)的效果較逍遙丸更為理想。觀察組的見栓率與胚胎著床率均高于模型組與陽性對照組，提示通過疏肝補(bǔ)腎中藥治療慢性應(yīng)激小鼠的妊娠功能可達(dá)到甚至優(yōu)于普通健康小鼠，說明疏肝補(bǔ)腎中藥具有明確的改善慢性應(yīng)激小鼠子宮內(nèi)膜容受性與妊娠能力的作用，且作用優(yōu)于逍遙丸治療。

綜上所述，疏肝補(bǔ)腎中藥在改善慢性應(yīng)激性小鼠子宮內(nèi)膜容受性方面具有明確療效，能夠有效改善慢性應(yīng)激模型小鼠子宮內(nèi)膜VEGF及LIF表達(dá)水平從而改善子宮微環(huán)境，提高妊娠成功率。