孫 柏， 潘天帆， 陸 建， 王 超， 王 勇， 常曉峰， 郭金和

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)肝癌發(fā)病率排第5位，致死率排第2位，占世界癌癥死亡患者的9.1%［1-2］。放射治療是肝癌治療的主要方式之一。外放療研究發(fā)現(xiàn)，隨著放射劑量的增加，肝臟放射性損傷尤其是肝臟纖維化的發(fā)生率及致死率也逐漸增加［3］。近年來，放射性125I粒子近距離治療因其微創(chuàng)、高精度、低劑量率、持續(xù)照射、可重復(fù)植入等優(yōu)點，在臨床應(yīng)用中取得了良好的效果。目前，125I粒子肝臟植入安全性的相關(guān)研究中，尚未見關(guān)于125I粒子植入后對肝臟放射性損傷肝臟纖維化的相關(guān)研究，為此，本實驗擬通過兔肝臟植入不同活度的125I粒子，判斷術(shù)前及術(shù)后6個月兔實驗指標(biāo)及肝臟病理學(xué)結(jié)果，進(jìn)行對比分析，來研究不同劑量、不同活度的125I粒子植入對肝臟纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康家兔16只，雌雄不拘，體重在2.5～4.0（3.2±0.6）kg。所有家兔在自由進(jìn)食和飲水的標(biāo)準(zhǔn)動物飼養(yǎng)室分隔喂養(yǎng)。

1.1.2 儀器與設(shè)備 不同活度的125I粒子（上海欣科醫(yī)藥有限公司）64粒；表面放射活度及粒數(shù)分別為：空倉粒子×16粒，2.22、2.96和 3.70 MBq各 16粒。籽源出廠前經(jīng)撿漏試驗、沾活檢驗、活度測量，合格者按A型包裝送動物手術(shù)實驗室。影像監(jiān)視設(shè)備：Sensation 64 層螺旋 CT（Siemens）。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組 16只實驗兔采用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為4組，每組4只，按照植入的粒子活度分別編號為A、B、C、D組，其中A組為空倉組，B組粒子活度為2.22 MBq，C組為2.96 MBq，D組為3.70 MBq。

1.2.2 操作過程及術(shù)后處理

1.2.2.1 術(shù)前每只實驗兔經(jīng)靜脈取血，行血細(xì)胞、肝功能、肝纖維化4項。

1.2.2.2 術(shù)前6 h禁食禁水，手術(shù)開始前于耳緣靜脈按1 mL/kg的劑量緩慢注射3%戊巴比妥那注射液，靜注速度為2 mL/min，注射藥物量達(dá)到總量的90%時判斷實驗兔神經(jīng)反射情況，按需給予剩余藥物或加量。

1.2.2.3 粒子植入前計算并取出所需數(shù)量的粒子，于2%戊二醛溶液中浸泡20 min，經(jīng)無菌0.9%NaCl溶液沖洗后，置入粒子釋放裝置中。植入時將釋放裝置對準(zhǔn)穿刺針的操作孔，按順序激發(fā)扳機(jī)即可。

1.2.2.4 麻醉滿意的實驗兔取左側(cè)臥位，固定于操作臺，行腹部CT平掃，確定CT橫斷位掃描下肝臟掃描的最大層面為穿刺層面，確定穿刺點、穿刺路徑、深度（圖1①）。標(biāo)準(zhǔn)消毒，無菌操作，取碘粒子植入針2支，沿預(yù)定穿刺點及穿刺路徑以間隔1 cm平行排列的方式穿刺至預(yù)定深度（圖1②），拔出穿刺針針芯，取裝配好的粒子釋放裝置，通過針芯每穿刺針?biāo)腿?顆粒子，后撤1 cm，再次推送1顆粒子；采用粒徑1 000 μm的明膠海綿栓塞針道；CT掃描觀察粒子排布情況及穿刺路徑出血情況。術(shù)后12 h恢復(fù)正常飲食。粒子植入過程見圖1。

1.2.2.5 術(shù)后利用計算機(jī)治療計劃系統(tǒng)（TPS）分別勾畫B、C、D組家兔中植入粒子的120 Gy、140 Gy、160 Gy等劑量曲線圖，并計算與中心點距離。按照B、C、D組相應(yīng)放射劑量的平均距離計算A組的距離粒子中心點的距離。

1.2.3 實驗兔的觀察及處死 ①術(shù)后評價實驗兔一般狀況，包括進(jìn)食量、活動狀況；②術(shù)后6個月每只實驗兔再次經(jīng)靜脈取血，復(fù)查血細(xì)胞、肝功能、肝纖維化4項、凝血功能等指標(biāo)；③術(shù)后6個月處死所有實驗兔，剖腹取出肝臟組織，DSA下確定粒子位置，分別按照計算距離選取每組實驗兔120 Gy、140 Gy、160 Gy輻射劑量區(qū)周邊的肝臟組織，4%甲醛浸泡、固定，行HE及天狼猩紅染色，行Knodell HAI評分。

1.2.4 評價指標(biāo) 術(shù)后兔進(jìn)食及活動情況；兔血實驗室檢查結(jié)果：肝功能、血常規(guī)、肝纖維化4項、APRI指數(shù)；病理學(xué)結(jié)果：HE染色、天狼猩紅染色、Knodell HAI評分。其中：Knodell HAI評分標(biāo)準(zhǔn)為：0分：無纖維化；1分：匯管區(qū)擴(kuò)大；2分：多數(shù)匯管區(qū)纖維化±短纖維間隔；3分：橋接區(qū)纖維化、匯管-匯管區(qū)纖維化或匯管中央橋接區(qū)纖維化；4分：肝硬化。

圖1 粒子植入過程

1.3 統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行處理，計量資料以（±s）表示，各組連續(xù)資料測值之間的差異采用單因素方差分析；統(tǒng)計結(jié)果以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

所有手術(shù)均順利完成，術(shù)中無實驗兔意外死亡。術(shù)后1周內(nèi)，家兔活動減少，進(jìn)食減少，2周左右基本恢復(fù)正常。

2.1 各組實驗兔血肝纖維化4項測定結(jié)果

A組術(shù)前與術(shù)后各項肝纖維化四項指標(biāo)組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C間P值分別為：0.17、0.155、0.254、0.282）。 B、C、D 組之間，隨著粒子活度的增加，各項指標(biāo)測定結(jié)果有升高的趨勢，且3組彼此之間以及與A組結(jié)果間均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），但是各組指標(biāo)基本處于正常范圍內(nèi)。見表2。

2.2 各組實驗兔谷草轉(zhuǎn)氨酶、血小板、APRI指數(shù)結(jié)果

分析ALT、AST結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C組與D組結(jié)果較其余3組明顯有升高，且超出正常高值，但C、D兩組之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義（PALT＝0.196、PAST＝0.154）；APRI比較顯示：A組術(shù)前、A組術(shù)后、B組3組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，C組與D組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，但是術(shù)前組、A組、B組3組均與C組、D組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且后兩組較前3組APRI值有明顯升高，但是所有組的APRI＜0.50。見表3。

表1 Knodell HAI肝纖維化評分標(biāo)準(zhǔn)

表2 各組家兔肝臟纖維化4項測定結(jié)果±s

表2 各組家兔肝臟纖維化4項測定結(jié)果±s

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表3 各組家兔各組家兔谷ALT、AST、PLT、APRI指數(shù)結(jié)果 ±s

表3 各組家兔各組家兔谷ALT、AST、PLT、APRI指數(shù)結(jié)果 ±s

注： APRI=[AST（U/L）/AST 正常值上限（U/L）/PLT（×10^9/L）]×100

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2.4 組織病理學(xué)觀察

在所有病理標(biāo)本中，A組所有肝組織肝索、肝竇結(jié)構(gòu)存在，肝細(xì)胞輪廓清晰，結(jié)構(gòu)完整，未見明顯肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，肝臟纖維化評分均為0分；B組中，放射劑量為160 Gy的病理標(biāo)本中有1只兔病理結(jié)果內(nèi)可見較多量細(xì)胞凋亡，評分為1分，其余所有B組肝臟觀察結(jié)果與A組相仿，評分為0分。C組與D組的病理標(biāo)本中，僅D組中照射劑量為160 Gy的病理中有1只兔未見明顯肝細(xì)胞損傷，評分為0分，其余絕大部分肝臟標(biāo)本的HE染色中，可見肝竇管壁變厚內(nèi)皮化、肝細(xì)胞脂肪變性、炎細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞融合，評分為1分。其中，D組較C組程度稍有加重。在天狼猩紅染色片中，D組中照射劑量為160 Gy的病理標(biāo)本中可見輕度肝竇管壁紅染，纖維組織增生外（圖2），余病理標(biāo)本均未見明顯異常。與HE染色結(jié)果基本吻合。

圖2 肝臟標(biāo)本組織學(xué)比較

分析結(jié)果顯示同一組內(nèi)，不同照射劑量的病理結(jié)果Knodell HAI評分相近，但是隨著粒子活度的不斷增加，即使輻射劑量較低時，也可發(fā)現(xiàn)Knodell HAI評分有升高的趨勢，但是評分不達(dá)到肝臟纖維化級別。

3 討論

125I粒子植入在臨床惡性腫瘤治療中的應(yīng)用越來越廣泛［4-5］。125I粒子源能夠持續(xù)釋放27.4～31.4 KeV的X射線和35.5 KeV的γ射線，人體組織穿透距離短，放射性粒子植入具有高度適形性、靶區(qū)與正常組織分配比高等優(yōu)點［6］。目前，125I粒子植入在治療肝臟惡性腫瘤方面取得了良好的效果。鄭家平等［7］報道40例難治性肝癌患者接受125I粒子植入治療，療效分析顯示近期客觀有效率37.5%，疾病控制率達(dá)到75%，中位腫瘤進(jìn)展時間和中位總生存時間分別為7個月和10個月。劉健等［8］報道125I粒子植入治療32例肝門區(qū)肝癌，結(jié)果顯示患者中位生存時間為10個月，總有效率為68.8%。但在上述相關(guān)文獻(xiàn)報道中，TPS中的碘粒子植入的處方劑量在120～160 Gy，且粒子活度的選擇沒有明確的參考［7-8］。大量研究發(fā)現(xiàn)，肝臟腫瘤是放療中度敏感器官［9］，放射性肝損傷是肝癌放療過程中最嚴(yán)重的劑量依賴性并發(fā)癥，放療患者中約有75%患者會出現(xiàn)肝功能不全及肝臟纖維化［10，11］，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量及預(yù)后［12］。 張冰等［13］研究發(fā)現(xiàn)125I粒子植入術(shù)后第1、2個月肝功能檢查顯示轉(zhuǎn)氨酶水平較術(shù)前明顯升高，且存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；而王福安等［14］的相關(guān)動物研究證實：當(dāng)肝臟植入的125I粒子活度＜0.7 mCi時相對安全，但是該實驗并未涉及劑量方面的研究，且實驗時間跨度相對較短。因此，探究不同劑量、不同活度125I粒子植入是否會導(dǎo)致肝臟慢性損傷，尤其是肝臟纖維化，具有一定的實際意義。

本研究采用臨床常用活度的125I粒子進(jìn)行動物實驗，探討不同活度、不同劑量粒子植入術(shù)后肝功能、血常規(guī)、肝纖維化4項等指數(shù)的變化情況及粒子源旁不同劑量區(qū)域肝臟形態(tài)學(xué)變化，來研究不同活度125I粒子植入對肝臟纖維化的影響。實驗室檢查結(jié)果提示：125I粒子植入術(shù)后6個月，隨著粒子活度的增高，高活度組兔ALT、AST均較低活度組及對照組有輕度升高，且其間存在統(tǒng)計學(xué)差異，說明隨著粒子活度達(dá)到一定程度后，會導(dǎo)致肝臟的慢性損傷；LN、PCⅢ、Ⅳ-C、HA、APRI指數(shù)均沒有達(dá)到肝臟纖維化的程度，但是隨著粒子活度的增加，各項指標(biāo)值有明顯升高的趨勢，且低活度組與高活度組之間差異存在統(tǒng)計學(xué)意義，這提示隨著粒子活度的增加，肝臟纖維化的風(fēng)險是存在的，這與對應(yīng)組的病理結(jié)果相一致。上述結(jié)果提示：125I粒子植入治療肝臟惡性腫瘤時，粒子活度的選擇需要慎重考慮。且當(dāng)植入的粒子活度較高時，術(shù)后可以適當(dāng)使用保肝藥物。

本研究病理結(jié)果顯示，在肝臟內(nèi)植入的粒子照射劑量小于160 Gy、粒子活度小于3.7 MBq時，所產(chǎn)生的內(nèi)照射均不會導(dǎo)致肝臟纖維化。但在不同活度的分析中我們發(fā)現(xiàn)，高活度組的病理切片染色中肝竇管壁內(nèi)皮化、肝細(xì)胞脂肪變性、炎細(xì)胞浸潤、細(xì)胞融合等病理學(xué)改變較低活度組明顯增多；且隨著粒子活度的增加，肝臟纖維化評分有明顯升高的趨勢。說明較大活度的碘粒子植入后釋放的γ射線會引起周圍肝組織的損傷，但該損傷尚不至于導(dǎo)致肝臟纖維化。研究顯示，凋亡可能是低劑量率輻射起到殺傷作用的主要機(jī)制［15］。另有體外研究發(fā)現(xiàn)，125I粒子照射可改變細(xì)胞周期分布，使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，抑制細(xì)胞分裂、增生，甚至導(dǎo)致其死亡，且隨著粒子活度增加，效果有逐漸增強(qiáng)的趨勢［16-17］。這與本研究結(jié)果基本吻合。

Park等［18］早期研究發(fā)現(xiàn)，在外放療總照射劑量小于 40 Gy、40～50 Gy、大于 50 Gy的患者中，肝臟毒性的發(fā)生率分別為4.2%、5.9%和8.4%；而在本實驗的每組對照組中，在相同粒子活度下，粒子的不同劑量組病理標(biāo)本評分之間未見統(tǒng)計學(xué)差異。這至少提示我們，125I粒子植入患者，在不考慮粒子活度的前提下，TPS中的處方劑量在≤160 Gy時，均可認(rèn)為是安全的。這與目前臨床治療肝癌患者常使用的處方劑量是相吻合的［19］?？紤]可能與粒子植入后放射線是緩慢持續(xù)釋放存在一定關(guān)系，也可能與機(jī)體自身適應(yīng)和抵抗存在一定關(guān)系，但具體原因尚需要深入研究。同時，更大內(nèi)照射劑量是否會導(dǎo)致肝臟慢性損傷、肝臟纖維化，有待進(jìn)一步研究驗證。

此外，本研究中的肝臟纖維化4項、APRI指數(shù)等反映肝臟纖維化的實驗室檢查結(jié)果與肝臟病理結(jié)果相吻合，在某種程度上提示我們，肝臟纖維化4項、APRI指數(shù)評價肝纖維化程度是相對可靠的，在臨床工作中尤其是當(dāng)遇到難以取得病理結(jié)果的情況下，對于是否給予患者加強(qiáng)保肝及抗纖維化治療，上述實驗室指標(biāo)具有一定的參考意義。

然而，本實驗還存在一定的缺陷。首先，粒子放射是緩慢衰減的，雖然選取的肝臟不同劑量點組織盡可能接近所需目標(biāo)值，但是與真正的放射劑量點之間仍存在一定的誤差。其次，肝臟粒子植入在臨床上常用于治療肝臟惡性腫瘤，本實驗因考慮到肝癌模型兔的生存時間，未予建模。最后，本實驗為盡可能分析劑量、活度等因素對肝臟纖維化的影響，分組較多，雖然樣本量符合統(tǒng)計學(xué)要求，但是樣本相對較少，這些將在后續(xù)實驗中進(jìn)一步完善。

總之，在目前臨床常用處方劑量下的肝臟125I粒子植入是安全的，并不會導(dǎo)致肝臟纖維化；但是，在粒子活度的選擇方面，仍需要慎重考慮。更大區(qū)間的不同活度、不同劑量的125I粒子對肝臟纖維化的影響，有待進(jìn)一步的研究結(jié)果來驗證。