任春慧，張娟，堵國(guó)成，陳堅(jiān)

?

基于融合雙親短肽提高葡萄糖氧化酶的熱穩(wěn)定性

任春慧1,4，張娟1,4，堵國(guó)成2,4，陳堅(jiān)3,4

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122 2 江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122 3 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122 4 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122

金城. 2018酶工程?？蜓? 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(7): 1021?1023.Jin C. Preface for special issue on enzyme engineering (2018). Chin J Biotech, 2018, 34(7): 1021?1023.

葡萄糖氧化酶 (Glucose oxidase，簡(jiǎn)稱GOD) 可氧化葡萄糖生產(chǎn)葡萄糖酸及其衍生物，在新型無(wú)抗飼料添加劑的開(kāi)發(fā)中具有良好的應(yīng)用潛力，但其生產(chǎn)加工過(guò)程中尚存在熱穩(wěn)定差的瓶頸問(wèn)題。本研究采用融合雙親短肽技術(shù)提高葡萄糖氧化酶的熱穩(wěn)定性，分別選取8種不同氨基酸長(zhǎng)度、不同Linker連接的雙親短肽 (Self-assembling peptides，SAPs) 融合至黑曲霉來(lái)源的葡萄糖氧化酶的N端，構(gòu)建了8種融合型酶SAP1-GS-GOD、SAP1-PT-GOD、SAP2-PT-GOD、SAP3-PT-GOD、SAP4-PT-GOD、SAP5-PT-GOD、SAP6-PT-GOD、SAP7-PT-GOD，并在畢赤酵母GS115中異源表達(dá)。獲得的連接PT Linker的融合酶在60 ℃下孵育60 min后的相對(duì)酶活均高于初始酶。其中，融合酶SAP5-PT-GOD在60 ℃下孵育30 min的相對(duì)酶活為67%，是相同處理?xiàng)l件下初始酶相對(duì)酶活的10.9倍。同時(shí)，融合酶SAP1-PT-GOD、SAP2-PT-GOD、SAP3-PT-GOD、SAP5-PT-GOD的cat/m值較初始酶均有進(jìn)一步的提高。研究表明，在葡萄糖氧化酶的N端融合以PT為L(zhǎng)inker的目標(biāo)雙親短肽能有效提高葡萄糖氧化酶的熱穩(wěn)定性，通過(guò)對(duì)融合酶分子內(nèi)作用力進(jìn)行分析，酶分子內(nèi)氫鍵的增加對(duì)融合酶熱穩(wěn)定性的提高效果最為顯著。上述研究獲得的熱穩(wěn)定性提高的融合葡萄糖氧化酶及其效果機(jī)制分析對(duì)提高酶在加工和應(yīng)用過(guò)程中的活性具有重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。

融合蛋白，雙親短肽，葡萄糖氧化酶，熱穩(wěn)定性

葡萄糖氧化酶 (Glucose oxidase，GOD) 是同型二聚體結(jié)構(gòu)，每個(gè)亞基分為兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：一個(gè)區(qū)域主要由β-折疊組成，以非共價(jià)鍵與黃素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) 輔酶分子緊密結(jié)合；另一個(gè)區(qū)域則由4個(gè)α-螺旋支撐1個(gè)反平行的β-折疊組成，可與底物β-D-葡萄糖結(jié)合[1]。該酶能將β-D-葡萄糖催化氧化成葡萄糖酸內(nèi)酯與過(guò)氧化氫，其中葡萄糖酸內(nèi)酯能夠在非酶促反應(yīng)下轉(zhuǎn)化成葡萄糖酸。葡萄糖氧化酶作為工業(yè)酶制劑中的重要成員之一，在食品工業(yè)、生物傳感器和酶生物燃料電池方面都有廣泛應(yīng)用[2]。

近年來(lái)，葡萄糖氧化酶作為替代抗生素的新型飼料酶制劑，具有保護(hù)動(dòng)物腸道、促進(jìn)消化吸收、提高動(dòng)物機(jī)體免疫力等多種功能[4]。目前，用于飼料行業(yè)的葡萄糖氧化酶年需求量可達(dá)30萬(wàn)t，年總產(chǎn)值在100億元以上，其需求量也以每年10%–30%的速度逐年遞增[3]。飼料酶等添加劑的制作過(guò)程通常需要經(jīng)過(guò)造粒工藝，在該過(guò)程中會(huì)由于瞬間高溫而對(duì)酶的活性造成影響。因此，提高GOD的熱穩(wěn)定性，可以有效降低催化反應(yīng)過(guò)程中用于溫度控制的水電能耗，并提高GOD制劑化產(chǎn)品的酶活性能，具有良好的應(yīng)用前景。

目前，提高酶熱穩(wěn)定性的方法主要有非理性設(shè)計(jì) (如DNA改組、易錯(cuò)PCR、體外隨機(jī)重組等)以及理性設(shè)計(jì) (如借助計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變等)。Zheng等利用定向進(jìn)化提高了木聚糖酶的熱穩(wěn)定性，其最適溫度也提高了10 ℃。Yuan等通過(guò)增加南極假絲酵母脂肪酶催化活性中心位點(diǎn)的剛性來(lái)提高酶的熱穩(wěn)定性，利用迭代飽和突變，獲得的突變體D223G/L278M在48 ℃下半衰期增加為野生酶的13倍。但是，由于前者需要建立合適的高通量篩選方法，而后者需要對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行大量的計(jì)算模擬，均難以保障方法的高效性和普適性。雙親自組裝肽 (Self-assembling peptides，SAPs) 是由相互交替的親水性和疏水性氨基酸組成，能夠聚集形成有序的納米結(jié)構(gòu)，主要應(yīng)用于納米技術(shù)領(lǐng)域、細(xì)胞培養(yǎng)和分子電子學(xué)。雙親自組裝肽的功能取決于氨基酸序列的排列順序、肽鏈的長(zhǎng)度及其所處環(huán)境的理化條件，從而形成各種納米結(jié)構(gòu)，包括納米囊泡、納米管和納米閥門(mén)。近年來(lái)，利用SAPs改造酶特性的嘗試引起了廣泛的關(guān)注。Liu等在脂肪氧合酶的N端融合釀酒酵母Zuotin蛋白等來(lái)源的6種自組裝雙親短肽 (SAPs)，使該酶在55 ℃的半衰期提高了2.3?4.5倍。進(jìn)一步的研究表明，Linker的種類對(duì)融合酶的性質(zhì)也有較大的影響[6]。

前人研究表明，畢赤酵母具有翻譯后修飾的潛力，并與蛋白質(zhì)折疊加工、二硫鍵的形成、特定類型脂質(zhì)的添加和O-端與N-端糖基化有關(guān)，它不僅克服了原核表達(dá)系統(tǒng)背景蛋白多、不能表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)、表達(dá)質(zhì)粒易丟失等缺陷，同時(shí)還彌補(bǔ)了高等真核表達(dá)系統(tǒng)操作復(fù)雜、表達(dá)水平低和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)成本高的不足，具有其他酵母表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法比擬的優(yōu)越之處。在本研究前期的研究中，Gu等已成功將GOD基因在畢赤酵母中表達(dá)，同時(shí)通過(guò)模塊化策略獲得了高產(chǎn)GOD的菌株，在3 L罐上發(fā)酵酶活達(dá)到1 972.9 U/mL，是目前報(bào)道的GOD的最高酶活水平，本研究是之前研究的延續(xù)和深化。本研究選擇了8種SAPs，融合于GOD的N端，在畢赤酵母中進(jìn)行了異源表達(dá)。與之前研究中僅用于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的融合雙親短肽重組酶相比，本研究中以真核生物畢赤酵母作為表達(dá)宿主，這對(duì)融合酶熱穩(wěn)定性提升策略而言是一次有效的嘗試，另外，研究獲得的熱穩(wěn)定性提高的GOD融合酶對(duì)拓展新型無(wú)抗飼料的應(yīng)用功效亦具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia ，畢赤酵母Pichia GS115，重組質(zhì)粒pPIC9k-。

1.1.2 主要試劑

實(shí)驗(yàn)中所用的限制性內(nèi)切酶BⅠ、Ⅰ購(gòu)自Thermo公司。Prime STAR (HS) DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒等購(gòu)自TaKaRa公司。SDS-PAGE凝膠試劑盒、蛋白電泳marker購(gòu)自碧云天公司。實(shí)驗(yàn)所用蛋白胨、酵母粉為Oxoid公司購(gòu)買(mǎi)。篩菌所用遺傳霉素G418購(gòu)自上海生物工程有限公司，引物合成及測(cè)序也均由上海生工有限公司完成。其他常規(guī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母粉，10 g/L NaCl，pH 7.0。

YPD：10 g/L酵母膏，20 g/L蛋白胨，10 g/L葡萄糖。

MD：13.4 g/L YNB，0.4 mg/L生物素，20 g/L葡萄糖。

BMGY：10 g/L酵母膏，20 g/L蛋白胨，10 g/L甘油，0.1 mmol/L磷酸緩沖液 (pH 6.0)，13.4 g/L YNB，0.4 mg/L生物素。

BMMY：10 g/L酵母膏，20 g/L蛋白胨，10 g/L甲醇，0.1 mmol/L磷酸緩沖液(pH 6.0)，13.4 g/L YNB，0.4 mg/L生物素。

YPD-G418：YNB 13.4 g/L，生物素0.4 mg/L，葡萄糖20 g/L。添加遺傳霉素0.25、1.00、2.00、3.00、4.00 mg/mL，用于陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子拷貝數(shù)的篩選。

1.2 方法

1.2.1 畢赤酵母工程菌Pichia GS115 (pPIC9K-SAPs-) 的構(gòu)建

SAPs的編碼基因由江南大學(xué)劉松老師惠贈(zèng)，編碼基因序列如表1所示。同時(shí)，針對(duì)SAP1的3′端分別引入GS基因和PT基因，針對(duì)SAP2、SAP3、SAP4、SAP5、SAP6和SAP7其3′端均引入PT基因。GS基因和PT基因序列見(jiàn)表2。

用表3中引物擴(kuò)增SAP1-GS-、SAP1-PT-、SAP2-PT-、SAP3-PT-、SAP4-PT-、SAP5-PT-、SAP6-PT-、SAP7-PT-基因，通過(guò)在引物5′和3′端引入線性化pPIC9k-載體末端的同源序列，使得插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物的5′和3′最末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對(duì)應(yīng)的完全一致的序列 (15 bp)，其中使用B Ⅰ酶切線性化載體。

表1 雙親短肽的氨基酸序列

Note: the linker sequences between the same SAP are marked out of the underline.

表2 Linker的種類及特性

表3 引物序列

Note: the underlined part of the table is the homologous arm sequence that is consistent with the two terminal sequence of the linearized vector.

將用BⅠ酶切線性化載體和要插入的短肽的序列利用一步克隆法進(jìn)行同源重組，重組的反應(yīng)體系見(jiàn)表4。其中，SAPs-GOD融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建如圖1所示。

將重組后的質(zhì)粒pPIC9k-SAPs-轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布到含有氨芐青霉素的固體LB平板中培養(yǎng)。菌落PCR驗(yàn)證呈陽(yáng)性的克隆菌株，提取其質(zhì)粒送到上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。將上述構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒pPIC9k-SAPs-用快切酶Ⅱ線性化，將線性化之后的質(zhì)粒按照畢赤酵母轉(zhuǎn)化手冊(cè)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

1.2.2 重組菌的發(fā)酵

挑取轉(zhuǎn)化后MD板上的轉(zhuǎn)化子25個(gè)到含G418抗性的YPD平板上 (G418抗性濃度梯度為1、2、3、4 mg/mL)，挑取4 mg/mL濃度的抗性YPD板上的重組菌5–10個(gè)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

種子培養(yǎng)：挑取YPD平板上的單菌落到25 mLYPD液體培養(yǎng)基 (250 mL搖瓶) 中于30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)18?20 h。

搖瓶發(fā)酵：將種子液按10%接入50 mL BMGY培養(yǎng)基中 (500 mL搖瓶)，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，將所有菌體離心并用等體積生理鹽水洗滌2遍，離心，將全部菌體轉(zhuǎn)入到BMMY培養(yǎng)基中。BMMY培養(yǎng)基初始甲醇添加量為1%，在30 ℃、220 r/min條件下誘導(dǎo)產(chǎn)酶，之后每24 h添加1%的甲醇，同時(shí)每隔24 h取少量樣品進(jìn)行酶活力測(cè)定。

表4 線性化質(zhì)粒與短肽序列融合的反應(yīng)體系

圖1 pPIC9k-SAPS-GOD重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.3 葡萄糖氧化酶的純化

將發(fā)酵液在8 000 r/min條件下離心10 min，取上清。將上清液用25 kDa的透析袋在0 ℃ Tris-HCl緩沖液中透析過(guò)夜。將透析后所得的酶液用HitrapTMQ HP柱純化。使用AKTA蛋白純化儀進(jìn)行蛋白分離純化，柱純化條件如下：用10倍柱體積的緩沖液A (20 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 7.0) 平衡陰離子柱，并以1 mL/min的流速進(jìn)樣；等待進(jìn)樣結(jié)束后，使用5個(gè)柱體積的緩沖液A沖平柱子；并以0?100%的緩沖液B (20 mmol/L Tris-HCl+100 mmol/L NaCl緩沖液，pH 7.0) 以3 mL/min的流速進(jìn)行線性洗脫。在60?80 mmol/L NaCl濃度時(shí)出現(xiàn)紫外吸收峰，對(duì)出現(xiàn)紫外吸收峰的樣品進(jìn)行收集，測(cè)定酶活，并于4 ℃條件下保存酶液。

1.2.4 葡萄糖氧化酶酶活的測(cè)定

葡萄糖氧化酶GOD酶活的測(cè)定：先后加入2.5 mL鄰聯(lián)茴香胺、0.3 mL 18%葡萄糖、0.1 mL辣根過(guò)氧化物酶，于35 ℃條件下保溫2 min，然后加入0.1 mL酶液，35 ℃條件下反應(yīng)3 min，并用2 mol/L的硫酸終止反應(yīng)。其中酶活測(cè)定過(guò)程中所需各溶液的配置如下：1) 檸檬酸緩沖液(pH 6.0)：一水合檸檬酸(C6H8O7·H2O) 3.95 g/L，二水合檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·2H2O) 23.82 g/L，調(diào)節(jié)pH為6.0；2) 鄰聯(lián)茴香胺溶液：1 g鄰聯(lián)茴香胺加在100 mL甲醇中攪拌溶解制成濃縮存儲(chǔ)液。現(xiàn)用現(xiàn)配，取0.1 mL濃縮液加入到上述檸檬酸緩沖液12 mL中混勻；3) 18%葡萄糖水溶液：葡萄糖180 g/L；4) 辣根過(guò)氧化物酶液：根據(jù)不同產(chǎn)品實(shí)際稀釋至100 U/mL。

葡萄糖氧化酶GOD酶活的定義：每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol葡萄糖為葡萄糖酸和過(guò)氧化氫所需的酶量為一個(gè)單位，用U表示。其中葡萄糖氧化酶酶活的計(jì)算方法如下：

=[Δ÷ (7.5××0.1)] ×5×

其中，表示酶活，單位為U/mL；Δ表示500 nm吸光值；表示酶活測(cè)定時(shí)間，單位為min；0.1表示樣品體積，單位為mL；5表示終反映體積，單位為mL；7.5表示消光系數(shù)，單位為1/m；表示稀釋倍數(shù)。

1.2.5SDS-PAGE分析

SDS-PAGE分析使用碧云天試劑盒SDS-PAGE預(yù)制膠，方法參照使用說(shuō)明書(shū)。并使用0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色。

1.2.6 蛋白濃度測(cè)定

蛋白濃度測(cè)定使用碧云天Bradford試劑盒，方法參照使用說(shuō)明書(shū)。同時(shí)通過(guò)酶活和蛋白濃度計(jì)算出葡萄糖氧化酶的比酶活。

1.2.7 葡萄糖氧化酶最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性的測(cè)定

最適反應(yīng)溫度的測(cè)定：將純化后的GOD酶液置于相同的測(cè)定體系中，在不同的溫度(20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、80 ℃) 條件下，測(cè)定其酶活。并將最高酶活值作為100%。

溫度穩(wěn)定性的測(cè)定：將純化后的GOD酶液分別在60 ℃條件下熱浴60 min，每隔10 min測(cè)定其相對(duì)酶活。將未熱浴處理的酶活作為100%。

1.2.8 葡萄糖氧化酶最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性的測(cè)定

最適反應(yīng)pH的測(cè)定：將純化后的GOD酶液置于相同的測(cè)定體系中，在pH 2.0?9.0 (pH 2.0? 8.0 20 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，pH 9.0 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液) 條件下，測(cè)定其酶活。并將最高酶活值作為100%。

pH穩(wěn)定性的測(cè)定：將純化后的GOD酶液分別在pH 2.0?9.0條件下于35 ℃保溫處理1 h，并測(cè)定其相對(duì)酶活。將最高酶活值作為100%。

1.2.9 葡萄糖氧化酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

葡萄糖氧化酶GOD動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定按照乒乓機(jī)制的雙底物(β-D-葡萄糖和氧氣) 反應(yīng)進(jìn)行。GOD在氧化反應(yīng)中可以催化不同底物，如氧、醌類物，而在還原反應(yīng)中對(duì)底物β-D-葡萄糖專一性嚴(yán)格。本研究中在測(cè)定動(dòng)力學(xué)常數(shù)時(shí)，反應(yīng)體系中的氧使用對(duì)苯醌代替。反應(yīng)中葡萄糖底物的濃度范圍為0?200 mmol/L，對(duì)苯醌底物濃度范圍為0?10 mmol/L。利用乒乓反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程雙倒數(shù)作圖法求出酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。本研究中的酶學(xué)常數(shù)均是針對(duì)葡萄糖底物作為主要研究對(duì)象。動(dòng)力學(xué)方程如下：

公式中：max代表最大反應(yīng)速率；與分別代表底物葡萄糖和對(duì)苯醌；mA與mB分別代表對(duì)葡萄糖和對(duì)苯醌的米氏常數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖氧化酶與雙親短肽融合酶的制備

雙親自組裝肽(Self-assembling peptides，SAPs)由相互交替的親水性和疏水性氨基酸形成，能夠聚集形成有序的納米結(jié)構(gòu)。本研究選用常見(jiàn)的GS柔性Linker和PT剛性Linker，首先將SAP1分別與柔性Linker和剛性Linker進(jìn)行連接，然后與GOD進(jìn)行融合。將這兩株重組菌進(jìn)行發(fā)酵，并將發(fā)酵液進(jìn)行純化，測(cè)定其相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)連接柔性Linker時(shí)融合酶的熱穩(wěn)定性較連接剛性Linker時(shí)差，因此在之后的改造研究中，將SAPs均與剛性Linker PT進(jìn)行連接。

將初始酶與融合酶的發(fā)酵上清進(jìn)行分離純化，使用陰離子柱HitrapTMQ HP對(duì)其進(jìn)行純化，在60?80 mmol/L NaCl濃度時(shí)出現(xiàn)紫外吸收峰，并對(duì)出現(xiàn)紫外吸收峰的樣品進(jìn)行收集。SDS-PAGE結(jié)果如圖2所示。

2.2 融合酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析

為了研究融合雙親短肽對(duì)重組葡萄糖氧化酶的影響，本研究考察了各個(gè)融合酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。如表5所示，融合酶SAP1-PT-GOD、SAP2-PT- GOD、SAP3-PT-GOD、SAP4-PT-GOD、SAP5-PT- GOD、SAP6-PT-GOD的m值較初始酶均明顯降低，其中SAP2-PT-GOD最為顯著，m值僅為初始酶的56%。同時(shí)，融合酶SAP2-PT-GOD、SAP5- PT-GOD的催化效率較初始酶提高最為顯著，較初始酶分別提升了40%和27%。

2.3 融合SAPs對(duì)葡萄糖氧化酶最適反應(yīng)溫度及其溫度穩(wěn)定性的影響

為了測(cè)定初始GOD和融合酶最適反應(yīng)溫度及其熱穩(wěn)定性的差異，我們選擇溫度梯度20 ℃?80 ℃測(cè)定其最適溫度，并于60 ℃進(jìn)行熱處理60 min，測(cè)定其耐高溫的能力。如圖3A所示，融合酶SAP1-GS-GOD的最適溫度為30 ℃，SAP1-PT-GOD、SAP2-PT-GOD、SAP3-PT-GOD融合酶和初始酶的最適溫度均為35 ℃，SAP4-PT-GOD的最適溫度為40 ℃，SAP5-PT- GOD、SAP6-PT-GOD和SAP7-PT-GOD的最適溫度為45 ℃。由圖3B可得，將初始酶和融合酶在60 ℃條件下處理60 min，60 min后連接PT Linker的融合酶的酶活殘留較初始酶均有所提高，只有連接GS Linker的融合酶的酶活殘留較初始酶降低。其中，融合酶SAP5-PT-GOD在60 ℃熱處理30 min后，其殘留酶活為67%，是相同熱處理?xiàng)l件下初始酶的10.9倍。其他融合酶SAP1-PT-GOD、SAP2-PT-GOD、SAP3-PT- GOD、SAP4-PT-GOD、SAP6-PT-GOD、SAP7-PT- GOD在60 ℃熱處理30 min后，相對(duì)初始酶的殘留酶活分別提高了1.8、2.0、1.7、2.6、3.8和2.6倍。綜上，通過(guò)對(duì)比SAP1-GS-GOD和SAP1-PT-GOD，可以看出雙親短肽與酶之間連接剛性Linker PT在熱穩(wěn)定性方面要比連接柔性Linker GS效果好。

圖2 GOD純化后的SDS-PAGE圖譜

表5 初始酶及融合酶的比酶活和動(dòng)力學(xué)常數(shù)

Note: the kinetic constants of these enzymes are all directed towards substrate glucose. The kinetic parameters of the enzyme are the average of the 3 experimental results, and the error is less than 5%.

圖3 溫度對(duì)初始GOD與SAPs-GOD融合酶的活性(A) 與穩(wěn)定性(B) 的影響

2.4 融合SAPs對(duì)葡萄糖氧化酶最適反應(yīng)pH及其pH穩(wěn)定性的影響

由圖4A可知，融合酶與初始酶的最適pH，均為6.0，但融合酶pH的范圍有所拓寬。通過(guò)對(duì)比SAP1-GS-GOD和SAP1-PT-GOD (圖4 B)，可以看出雙親短肽與酶之間連接剛性Linker PT在pH穩(wěn)定性方面要比連接柔性Linker GS效果好。連接剛性Linker PT的融合酶在pH 4.0?6.0的范圍內(nèi)，其相對(duì)酶活均在90%以上，明顯高于初始酶。

2.5 融合SAPs對(duì)葡萄糖氧化酶熱穩(wěn)定性提高的機(jī)制

根據(jù)前人研究，將短肽融合到酶的N端或C端提高酶分子穩(wěn)定性的機(jī)制主要為：分子局部剛性增加和酶分子的寡聚作用[15]。本研究使用PIC在線服務(wù)器分析了融合酶SAPs-GOD分子內(nèi)作用力的變化 (表6)。根據(jù)表6結(jié)果可以看出，融合酶SAP2-PT-GOD中的疏水相互作用較初始酶增加了2個(gè)，SAP4-PT-GOD、SAP5-PT-GOD、SAP6- PT-GOD和SAP7-PT-GOD中的疏水相互作用較初始酶均增加了6個(gè)。根據(jù)已有研究，疏水性是蛋白質(zhì)單體發(fā)生聚集的主要作用力。此外，大量關(guān)于嗜熱蛋白的研究表明，寡聚能夠增強(qiáng)蛋白質(zhì)單體間的相互作用并固定N端、C端及高柔性loop，從而提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。因此，本研究認(rèn)為短肽自身的疏水性使融合酶發(fā)生不同程度的寡聚，從而導(dǎo)致了融合酶熱穩(wěn)定性的增加。另外，SAP2-PT-GOD分子中的總氫鍵較初始酶增加了3個(gè)，SAP1-GS-GOD分子中的總氫鍵較初始酶降低了2個(gè)，SAP1-PT-GOD和SAP3-PT-GOD融合酶中的總氫鍵沒(méi)有變化，SAP4-PT-GOD、SAP5-PT-GOD、SAP6-PT-GOD和SAP7-PT-GOD融合酶中的總氫鍵較初始酶有所下降。通過(guò)對(duì)融合酶和初始酶氫鍵類型與數(shù)目變化的具體分析，SAP4-PT-GOD、SAP5-PT-GOD、SAP6-PT-GOD和SAP7-PT-GOD融合酶中主鏈與主鏈之間的氫鍵較初始酶增加了19個(gè)，其他種類的氫鍵數(shù)目均有不同程度的下降，對(duì)照2.3中的結(jié)果，這4種酶的熱穩(wěn)定性提高最為明顯。因此，融合酶中主鏈與主鏈之間氫鍵的增加是這幾種融合酶熱穩(wěn)定性增加的主要原因，其他類型氫鍵對(duì)融合酶的熱穩(wěn)定性影響不大。以上結(jié)果分析表明，分子內(nèi)作用力的改變可能是融合酶熱穩(wěn)定性提高的原因，其中分子內(nèi)疏水相互作用及主鏈與主鏈之間的氫鍵的增加對(duì)本研究中融合酶熱穩(wěn)定性的影響最為顯著[24-25]。

圖4 pH對(duì)初始GOD與SAPs-GOD融合酶的活性(A)和穩(wěn)定性(B)的影響

表6 初始GOD及SAPs-GOD融合酶分子內(nèi)作用力分析

另外，SAP1-GS-GOD和SAP1-PT-GOD的Linker分別為柔性和剛性，使用剛性的Linker更有利于GOD熱穩(wěn)定性的提高。對(duì)于由剛性Linker PT連接的7種融合酶，SAP2-PT-GOD、SAP4-PT- GOD、SAP5-PT-GOD、SAP6-PT-GOD和SAP7-PT- GOD的熱穩(wěn)定性較SAP1-PT-GOD、SAP3-PT- GOD提高得多，表明融合短肽的長(zhǎng)度可能是影響熱穩(wěn)定性的另一重要因素，且連接的雙親短肽其氨基酸長(zhǎng)度越長(zhǎng)融合酶熱穩(wěn)定性提升越多[15]。

3 討論

隨著葡萄糖氧化酶在食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域越來(lái)越多的應(yīng)用，由于在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用過(guò)程中，溫度的調(diào)控具有遲滯性，同時(shí)酶的制劑化過(guò)程中對(duì)酶的活性造成較大程度的損害。因此提高葡萄糖氧化酶的熱穩(wěn)定性具有重大的意義。本研究利用自組裝雙親短肽融合到葡萄糖氧化酶的N端，有效地提高了葡萄糖氧化酶的熱穩(wěn)定性，同時(shí)對(duì)于其pH穩(wěn)定性也有一定程度的提高。研究表明，連接PT Linker的融合酶的熱穩(wěn)定性較連接GS Linker高，雙親短肽的氨基酸序列越長(zhǎng)融合酶的熱穩(wěn)定性越高。綜上表明，通過(guò)調(diào)整雙親短肽連接Linker的種類以及短肽氨基酸序列的長(zhǎng)度，可以獲得熱穩(wěn)定性顯著提高的融合酶。此外，相較之前僅以大腸桿菌等原核生物作為表達(dá)宿主進(jìn)行的研究，本研究將真核生物畢赤酵母作為表達(dá)宿主，對(duì)應(yīng)用雙親短肽融合技術(shù)提高真核生物外源蛋白表達(dá)的酶學(xué)穩(wěn)定性具有一定的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Enhancing thermal stability of glucose oxidase by fusing amphiphilic short peptide

Chunhui Ren1,4, Juan Zhang1,4, Guocheng Du2,4, and Jian Chen3,4

1Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 3 National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 4 College of Bioengineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Glucose oxidase catalyzes the oxidation of β-D-glucose to gluconic acid and its derivatives, thus shows a great potential in the development of antibiotic-free feed. However, its production and processing still have the problem of poor thermal stability of enzyme activity. In this study, fusion of amphiphilic peptide technology was used to improve the stability of glucose oxidase. Herein, eight self-assembling peptides with different amino acid lengths and Linkers were fused to the N terminus of the glucose oxidase, yielding eight chimeric fusions SAP1-GS-GOD, SAP1-PT-GOD, SAP2-PT-GOD, SAP3-PT-GOD, SAP4-PT-GOD, SAP5-PT-GOD, SAP6-PT-GODandSAP7-PT-GOD. Then, the 8 recombinant proteins were expressed inGS115. After separation and purification, the stability of glucose oxidase at 60 ℃was determined. The relative enzyme activities of the PT Linker-linked fusion enzyme incubated at 60 ℃ for 60 min were higher than those of the original enzyme, and the relative activity of SAP5-PT-GODwas 67% at 60 ℃ for 30 min, which was 10.9 times higher than that of the initial enzyme with the same treatment. Among them, thecat/mvalue of SAP1-PT-GOD, SAP2-PT-GOD, SAP3-PT-GOD and SAP5-PT-GOD of the fusion enzyme was further improved than that of the initial enzyme. Through the analysis of the intramolecular force of the fusion enzyme, the increase of the thermal stability of the fusion enzyme is mainly due to the increase of the hydrogen bond. In summary, the study indicates that translational fusion of self-assembling peptides with PT Linker was able to augment the thermo-stability of glucose oxidase, which has certain potential in the production and application of glucose oxidase. The glucose oxidase with improved thermostability obtained in the above study and the related mechanism will play an important role in improving the activity of related enzymes in the proceeding of processing and application.

fused protein, amphiphilic peptide, glucose oxidase, thermal stability

January 10, 2018;

February 26, 2018

The Project of Jiangsu Province and Research Prospective Joint Research (No. BY2016022-39), National Natural Science Foundation of China (No. 31470160).

Juan Zhang. Tel: +86-510-85918309; E-mail: zhangj@jiangnan.edu.cn Guocheng Du.E-mail: gcdu@jiangnan.edu.cn

江蘇省產(chǎn)學(xué)研前瞻性聯(lián)合研究項(xiàng)目 (No. BY2016022-39)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31470160) 資助。

2018-03-14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180313.1733.002.html

10.13345/j.cjb.180019