張曉鳳，喻曉蔚，徐巖

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定點(diǎn)突變提高土曲霉Aspergillus terreus脂肪酶的催化活性

張曉鳳，喻曉蔚，徐巖

江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

金城. 2018酶工程專刊序言. 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(7): 1021?1023.Jin C. Preface for special issue on enzyme engineering (2018). Chin J Biotech, 2018, 34(7): 1021?1023.

本研究旨在利用理性設(shè)計(jì)的方法來(lái)提高來(lái)源于土曲霉的酸性脂肪酶ATL的催化活力。通過(guò)同源比對(duì)，選擇脂肪酶蓋子區(qū)域和底物結(jié)合口袋域中的位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到8種ATL的突變脂肪酶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蓋子區(qū)域突變酶ATLLid與底物結(jié)合口袋域突變酶ATLV218W的催化活性顯著提高。ATLLid和ATLV218W對(duì)底物對(duì)硝基苯酚月桂酸酯-nitrophenyl laurate (-NPL) 的催化活性最高，cat值較ATL分別提高了39.37倍和50.79倍，cat/m值較ATL分別提高了2.85倍和8.48倍。與ATL相比，ATLLid和ATLV218W的熱穩(wěn)定性略有下降，最適pH為5.0，pH 4.0–8.0具有較好的穩(wěn)定性，說(shuō)明突變未對(duì)ATL的嗜酸耐酸特性產(chǎn)生影響。通過(guò)同源建模模擬及分子對(duì)接技術(shù)分析底物-NPL與酶分子間的相互作用，解析了ATLLid和ATLV218W催化活性提高的機(jī)理。

土曲霉脂肪酶，畢赤酵母，同源建模，定點(diǎn)突變，催化活性，分子對(duì)接

脂肪酶 (EC 3.1.1.3) 又稱甘油三酯水解酶，廣泛分布于自然界中，是一類能在油水界面或水不溶系統(tǒng)進(jìn)行酯類水解或酯類合成的酶[1]。脂肪酶在食品、化工、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，因而對(duì)脂肪酶的催化活性提出了更高的要求。多數(shù)脂肪酶的最適作用pH在中偏堿性條件下，然而，研究人員發(fā)現(xiàn)在酸性條件下具有較高催化活性的酸性脂肪酶具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。例如，在醫(yī)藥行業(yè)中，酸性脂肪酶可用于治療胃腸紊亂、消化不良等疾病[2]；在食品行業(yè)中，酸性脂肪酶可在適當(dāng)條件下產(chǎn)生低級(jí)脂肪酸等風(fēng)味物質(zhì)，增強(qiáng)食品香味[3]；在飼料行業(yè)中，在幼畜幼禽的飼料中添加脂肪酶可以有效解決幼畜因消化機(jī)能尚未發(fā)育健全、內(nèi)源性脂肪酶分泌量不足而導(dǎo)致的早期斷奶產(chǎn)生的明顯應(yīng)激，避免對(duì)消化系統(tǒng)發(fā)育和消化酶分泌產(chǎn)生不良影響，并能提高飼料內(nèi)脂肪類物質(zhì)的利用率[4]。

曲霉屬脂肪酶在酸性環(huán)境中表現(xiàn)出良好的催化活性和耐受性，是獲取高性能酸性脂肪酶的重要來(lái)源之一[5-8]。其中對(duì)于黑曲霉來(lái)源的酸性脂肪酶研究更為廣泛，如產(chǎn)自黑曲霉AN0512的脂肪酶在pH 5.0時(shí)催化活性最高，且在pH 3.0–7.0范圍內(nèi)保持良好的穩(wěn)定性[9]；產(chǎn)自NICM 1207的脂肪酶在pH 2.5和45–50 ℃條件下水解活力最高，且在pH 2.5–9.0范圍內(nèi)可保持較高活性[5]。然而，黑曲霉來(lái)源的酸性脂肪酶生產(chǎn)工藝[10]和工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域[11]存在專利壁壘，因此亟待開(kāi)發(fā)其他來(lái)源的酸性脂肪酶，為工業(yè)應(yīng)用提供更多的酶源選擇。Shi等[7]發(fā)現(xiàn)了一種來(lái)自土曲霉A的酸性脂肪酶ATL，但僅對(duì)其進(jìn)行了酶學(xué)特性研究。ATL具有良好的耐酸性能，其最適pH為4.0，且在pH 3.0–12.0范圍內(nèi)活力穩(wěn)定。但是發(fā)酵脂肪酶活力較低，僅為13.7 U/mL，而且該酶催化活性低，比活力為24 U/mg[7]。

脂肪酶的蓋子區(qū)域?qū)γ富罹哂兄匾挠绊?。研究表明，?duì)脂肪酶蓋子區(qū)域進(jìn)行替換或定點(diǎn)突變等蛋白質(zhì)工程改造可使脂肪酶的催化活性和底物特異性發(fā)生變化。對(duì)來(lái)自sp.的脂肪酶基因LipK107的蓋子區(qū)域進(jìn)行定點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)突變酶E130L+K131I和T138V的蓋子區(qū)域疏水性增強(qiáng)，酶活性顯著增強(qiáng)；突變酶I128E+V129D卻使得蓋子區(qū)域疏水性減弱，相應(yīng)的酶活也有所降低[12]。說(shuō)明蓋子的氨基酸親疏水性對(duì)酶活具有重要影響作用。Skj?t等將南極假絲酵母脂肪酶B (CALB) 的“蓋子”替換成與其同源的來(lái)自粗糙鏈孢霉和玉米赤霉脂肪酶的相應(yīng)的“蓋子”，使得突變酶底物特異性發(fā)生改變，提高了對(duì)短鏈酯的水解活性，并且水解外消旋2-苯甲酸氨基乙酯的立體選擇性增強(qiáng)[13]。說(shuō)明蓋子的結(jié)構(gòu)可以改變脂肪酶的活性、底物特異性等方面的性質(zhì)。此外，脂肪酶的某些保守氨基酸也會(huì)對(duì)酶活產(chǎn)生影響。Mosbah等為了研究Gly311位點(diǎn)對(duì)脂肪酶的作用，將該位點(diǎn)突變成Leu、Trp、Asp和Lys，結(jié)果突變酶的酶活都降低了，且突變酶的最適pH也發(fā)生了改變[14]。

本研究將土曲霉來(lái)源的酸性脂肪酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在真核外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)ATL三維結(jié)構(gòu)模擬及多序列同源比對(duì)，利用理性設(shè)計(jì)的方法在脂肪酶的蓋子區(qū)域和底物結(jié)合口袋域選擇關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，以期提高ATL的催化活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌JM109和巴斯德畢赤酵母GS115由本實(shí)驗(yàn)室保存，分別用于載體擴(kuò)增和目的蛋白外源表達(dá)。表達(dá)載體pPIC9K由本實(shí)驗(yàn)室保存。土曲霉脂肪酶基因ATL序列(GenBank Accession No. XP_001218444.1)根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性優(yōu)化后，由南京金斯瑞公司合成。

1.1.2 培養(yǎng)基

大腸桿菌培養(yǎng)基LB：0.5% (/) 酵母浸出粉，1% (/) 胰蛋白胨，1% (/) NaCl，根據(jù)需要添加100 μg/mL氨芐青霉素 (Amp)。酵母培養(yǎng)基YPD、YPD-G418、MD、BMGY和BMMY根據(jù)“Invitrogen 公司操作手冊(cè)”方法配制。

1.1.3 酶與試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、PCR試劑購(gòu)自TaKaRa 寶生物公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR Purification Kit、Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit I購(gòu)自O(shè)MEGA BIO-TEK。對(duì)硝基苯酚酯-nitrophenyl系列底物：對(duì)硝基苯酚乙酸酯-nitrophenyl acetate (-NPA)、對(duì)硝基苯酚丁酸酯-nitrophenyl butyrate (-NPB)、對(duì)硝基苯酚戊酸酯-nitrophenyl valerate (-NPV)、對(duì)硝基苯酚辛酸酯-nitrophenyl caprylate (-NPC)、對(duì)硝基苯酚月桂酸酯-nitrophenyl laurate (-NPL)、對(duì)硝基苯酚豆蔻酸酯-nitrophenyl myristate (-NPM) 和對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯-nitrophenyl palmitate (-NPP) 購(gòu)自Sigma-Aldrich中國(guó)公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 定點(diǎn)突變、重組表達(dá)質(zhì)粒及工程菌的構(gòu)建

從NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到ATL基因（GenBank登錄號(hào)No. XP_001218444.1），以畢赤酵母密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，將優(yōu)化基因送南京金斯瑞公司合成，并在GS115中表達(dá)。利用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和Ⅱ分別對(duì)合成的ATL基因DNA片段和pPIC9K空載體進(jìn)行雙酶切，利用T4 DNA連接酶16 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB平板 (含100 μg/mL的Amp)，篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并提取得到重組質(zhì)粒pPIC9K-ATL。pPIC9K-ATL經(jīng)限制性內(nèi)切酶Ⅰ線性化后，利用電轉(zhuǎn)化法 (1 500 V，5 ms) 把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌GS115中，并將轉(zhuǎn)化物涂布于MD平板 (含250 μg/mL的G418)，30 ℃培養(yǎng)2–3 d后，可挑取較大的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌落，提取酵母基因組利用引物3?AOX1和5?AOX1進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到正確的重組菌株GS115/pPIC9K-ATL。具體電轉(zhuǎn)化及篩選方法參見(jiàn)Invitrogen公司操作手冊(cè)。

以pPIC9K-ATL為模板，分別以Lid-F和Lid-R上下游引物 (引物序列見(jiàn)表1) 進(jìn)行全質(zhì)粒PCR，得到突變后的質(zhì)粒pPIC9K-ATLLid。反應(yīng)體系為：模板1 μL；PrimerSTAR HS 25 μL；20 mmol/L的上下游引物各1 μL；加無(wú)菌水至總體積為50 μL。反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸11 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR Purification Kit試劑盒純化后，限制性內(nèi)切酶Ⅰ對(duì)PCR產(chǎn)物消化以降解模板質(zhì)粒，再經(jīng)過(guò)PCR Purification Kit試劑盒純化后，轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞。涂布于LB平板 (含100 μg/mL的Amp)，篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，可獲得突變質(zhì)粒pPIC9K-ATLLid。其余7種突變質(zhì)粒均按照該方法進(jìn)行構(gòu)建(引物序列見(jiàn)表1)，分別得到不同的突變質(zhì)粒：pPIC9K-ATLV218F、pPIC9K-ATLV218W、pPIC9K-ATLV218L、pPIC9K- ATLV218D、pPIC9K-ATLV218M、pPIC9K- ATLV218A、pPIC9K-ATLBP2。將突變后的質(zhì)粒參考上述構(gòu)建重組菌株GS115/pPIC9K-ATL的方法，得到8株突變株，分別為GS115/pPIC9K-ATLLid、GS115/ pPIC9K-ATLV218F、GS115/pPIC9K-ATLV218W、GS115/pPIC9K-ATLV218L、GS115/pPIC9K-ATLV218D、GS115/pPIC9K-ATLV218M、GS115/pPIC9K-ATLV218A和GS115/pPIC9K-ATLBP2。

表1 文中所用引物

The mutation sites are highlighted by bold.

1.2.2 脂肪酶的表達(dá)及蛋白純化

將重組菌株在含有250 μg/mL G418的YPD平板上劃線，30 ℃培養(yǎng)2–3 d。挑取一環(huán)平板上的單菌落，接種至25 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)16–20 h至600為2–6。 6 000 r/min 離心10 min，收集菌體并用100 mL的BMMY培養(yǎng)基重懸，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)120 h，每隔24 h添加1%的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)并且取樣檢測(cè)600、發(fā)酵液上清的蛋白濃度和酶活性。蛋白濃度的檢測(cè)使用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行定量[15]。

利用Ni-NTA鎳柱親和層析和AKTA purifier蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行重組蛋白的分離純化。發(fā)酵液4 ℃、6 000 r/min離心10 min后取上清液，用 0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾處理后方可上樣。上樣緩沖液為Buffer A (0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)，粗酶液上樣到已用Buffer A平衡的鎳柱上，再用含不同濃度咪唑 (0–0.25 mol/L) 的上樣緩沖液梯度洗脫吸附的蛋白，收集各洗脫峰流出液，SDS-PAGE進(jìn)行通過(guò)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。SDS-PAGE的制備和電泳方法參見(jiàn)《蛋白技術(shù)手冊(cè)》[16]，濃縮膠和分離膠濃度分別為5%和12%。

1.2.3 酶活測(cè)定

比色法：根據(jù)Kordel等[17]的方法，以對(duì)硝基苯酚月桂酸酯 (-NPL) 為底物進(jìn)行酶活測(cè)定。酶活的定義：一定反應(yīng)條件下每分鐘產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基苯酚的酶量為一個(gè)脂肪酶水解酶活國(guó)際 單位。

堿滴定法：參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T23535-2009方法[18]，橄欖油與4% (/) 聚乙烯醇 (PVA) 以1∶3 (/)的比例混合，用高速勻漿機(jī)處理后得到乳白色的乳化液。以乳化后的橄欖油作為脂肪酶水解底物。每個(gè)反應(yīng)體系包括4 mL橄欖油乳化液、5 mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液和1 mL酶液。該反應(yīng)被95%乙醇溶液終止，反應(yīng)釋放的脂肪酸由0.1 mol/L NaOH中和。酶活的定義：一定反應(yīng)條件下每分鐘產(chǎn)生1 μmol脂肪酸的酶量。

1.2.4 脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)研究

配制不同pH梯度的50 mmol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液 (pH 2.0–8.0) 和碳酸鹽緩沖液 (pH 9.0–10.0)，采用以橄欖油為底物的堿滴定法，測(cè)定脂肪酶的最適pH。測(cè)定pH穩(wěn)定性時(shí)，將酶液加入上述不同梯度的緩沖液，并放于4 ℃，每隔3 h利用堿滴定法檢測(cè)脂肪酶的殘存活力，以初始酶活為100%相對(duì)酶活。

將酶液在不同的溫度條件 (20–60 ℃) 下反應(yīng)，利用堿滴定法檢測(cè)脂肪酶的最適溫度。測(cè)定溫度穩(wěn)定性時(shí)，將酶液在不同溫度 (20–50 ℃) 中保溫，每隔0.5–1 h利用堿滴定法檢測(cè)脂肪酶的殘存活力，以初始酶活為100%相對(duì)酶活。

將純化后的脂肪酶與不同碳鏈長(zhǎng)度對(duì)硝基苯酚酯底物混合進(jìn)行顯色反應(yīng)，反應(yīng)條件為40 ℃、50 mmol/L的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0)，以檢測(cè)脂肪酶對(duì)底物鏈長(zhǎng)的特異性。使用的對(duì)硝基苯酚酯底物根據(jù)碳鏈長(zhǎng)度由短至長(zhǎng)依次為-NPA(C2)、-NPB(C4)、-NPV(C5)、-NPC(C8)、-NPL(C12)、-NPM(C14)和-NPP(C16)。

脂肪酶酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)max、m值、cat值的計(jì)算采用雙倒數(shù)作圖法 (Lineweaver-Burk plot) 和米氏方程 (Michaelis-Menten equation)。以對(duì)硝基苯酚酯-NPL和-NPP作為反應(yīng)底物，濃度范圍是0.1–0.9 mmol/L，反應(yīng)條件為40 ℃，50 mmol/L的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0)。

1.2.5 脂肪酶的同源建模

利用在線軟件對(duì)脂肪酶進(jìn)行同源建模(https://swissmodel.expasy.org/)，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的同源性較高的蛋白結(jié)構(gòu)，模擬出發(fā)脂肪酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)。計(jì)算機(jī)軟件Discovery Studio 3.1 viewer 和PyMOL對(duì)酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察與分析。

1.2.6 脂肪酶的分子對(duì)接

利用軟件AutoDock Vina進(jìn)行分子對(duì)接研究，以脂肪酶蛋白為受體，底物-NPL為配體構(gòu)建分子對(duì)接系統(tǒng)，分析突變前后的脂肪酶分子構(gòu)象的變化對(duì)脂肪酶催化活性的影響。對(duì)接參數(shù)設(shè)置為：配體可旋轉(zhuǎn)鍵12個(gè)；將ATL口袋區(qū)域設(shè)為格子中心；格子大小設(shè)置為X，Y，Z：62，43，43；晶格的中心(Center) 坐標(biāo)設(shè)為(–21.5，18.1，82.9)，其他參數(shù)為系統(tǒng)默認(rèn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 理性設(shè)計(jì)確定ATL突變位點(diǎn)

2.1.1 ATL的氨基酸序列與模擬三維結(jié)構(gòu)分析

已有研究表明,來(lái)自黑曲霉NICM 1207的酸性脂肪酶ANL在固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵條件下脂肪酶酶活分別為630 U/g (固態(tài)底物) 和18 U/mL[5]，純化后的比活力為1 373.13 U/mg[19]，酶活力遠(yuǎn)高于ATL已報(bào)道的數(shù)值 (24 U/mg)。ANL最適pH 和溫度分別為2.5和45–50 ℃，且在pH 2.5–9.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好[5]。因此，本研究將以黑曲霉脂肪酶ANL為參考依據(jù)，對(duì)土曲霉脂肪酶ATL進(jìn)行理性改造。ATL與ANL (GenBank Accession No. XP_001397501.1) 的氨基酸序列一致性為53.05% (圖1A)。鑒于還未有報(bào)道ANL和ATL的蛋白三維結(jié)構(gòu)，需利用在線工具模擬獲得這兩個(gè)蛋白的三維模擬結(jié)構(gòu)。將ATL和ANL分別進(jìn)行同源搜索比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這兩種脂肪酶預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)與來(lái)自疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶TLL (PDB登錄號(hào)1DT5) 相似性最高，分別為51.7%和50.37%，因此1DT5可作為模板結(jié)構(gòu)對(duì)ATL進(jìn)行同源建模。由于1DT5是閉蓋結(jié)構(gòu)，無(wú)法進(jìn)行底物與蛋白的分子對(duì)接，結(jié)合相似度較高的米黑根毛霉脂肪酶RML的開(kāi)蓋結(jié)構(gòu) (PDB登錄號(hào)4TGL) 信息模擬ATL的開(kāi)蓋結(jié)構(gòu) (圖1B)。

初中教育階段，所有學(xué)生每周都可以獲得由藝術(shù)家或經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的教師開(kāi)展的1小時(shí)造型藝術(shù)和1小時(shí)音樂(lè)培訓(xùn)。

2.1.2 ATL突變位點(diǎn)的確定

由于ATL在氨基酸序列和三維模擬結(jié)構(gòu)上都與ANL擁有較高的相似度，而且ANL具有較高的比活，因此通過(guò)參照ANL的氨基酸序列對(duì)ATL的催化活性區(qū)域的部分位點(diǎn)進(jìn)行選擇性突變?cè)O(shè)計(jì)。如圖1A所示，參考ANL的蓋子區(qū)域(92STIKNWIADLDFI104) 對(duì)ATL的蓋子區(qū)域(92RSPANWIANLDFI104) 進(jìn)行改造，利用全質(zhì)粒PCR的方法，將ATL的蓋子區(qū)域前4個(gè)氨基酸替換為Ser-Thr-Ile-Lys，得到突變酶ATLLid。ANL含有兩個(gè)底物結(jié)合口袋域（Binding pocket 1 domain和Binding pocket 2 domain）。在Binding pocket 1 domain中，ATL僅在Val218位點(diǎn)上不同于ANL中的相應(yīng)位點(diǎn)Phe219。將ATL中的Val218替換成Phe，得到突變酶ATLV218F。在Binding pocket 2 domain中，將ATL氨基酸區(qū)段265HSWYFGDISECQ276替換為ANL中的266HLWYFFAISECLL278得到突變酶ATLBP2。具體突變位點(diǎn)分布如圖1B所示。

2.1.3 ATL第218位點(diǎn)與ANL第219位點(diǎn)保守性分析

分別對(duì)ANL的Phe219和ATL的Val218的氨基酸保守性進(jìn)行分析(http://gremlin.bakerlab. org/submit.php)。結(jié)果表明(圖2)，ANL在219位點(diǎn)的保守性排序依次為亮氨酸Leu(L)、色氨酸Trp(W)、苯丙氨酸Phe(F) 和甲硫氨酸Met(M)，均為疏水性氨基酸。但也有較少情況下，該位點(diǎn)可能為天冬氨酸Asp(D) 和谷氨酰胺Asn(Q)。ATL在相應(yīng)218位點(diǎn)的保守性同樣為L(zhǎng)eu(L)、Trp(W)、Phe(F) 和Met(M)。此外，將ATL序列提交在線比對(duì)軟件(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，分析同源性較高的前100個(gè)序列的保守性，該位點(diǎn)還可能為丙氨酸Ala(A)、異亮氨酸Ile(I)。考慮到L與I性質(zhì)相仿，選擇其一作為突變點(diǎn)即可。綜上，選擇在ATL的第218位點(diǎn)除構(gòu)建ATLV218F外繼續(xù)構(gòu)建5種突變酶：ATLV218W、ATLV218L、ATLV218D、ATLV218M和ATLV218A。

圖1 氨基酸序列與三維結(jié)構(gòu)分析(A：ANL和ATL的氨基酸序列比對(duì)；B：ATL三維結(jié)構(gòu)模擬圖)

2.2 重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化

將表達(dá)野生型脂肪酶的菌株GS115/pPIC9K- ATL與8株表達(dá)突變酶的菌株GS115/pPIC9K- ATLLid、GS115/pPIC9K-ATLV218F、GS115/pPIC9K- ATLV218W、GS115/pPIC9K-ATLV218L、GS115/ pPIC9K-ATLV218D、GS115/ pPIC9K-ATLV218M、GS115/pPIC9K-ATLV218A和GS115/pPIC9K- ATLBP2進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。設(shè)置3個(gè)平行，定時(shí)取樣，檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程中菌體的生長(zhǎng)情況、胞外總蛋白分泌情況和上清液中酶活的變化。如圖3所示，當(dāng)甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵至96 h時(shí)，以-NPL為底物，突變菌株GS115/pPIC9K-ATLLid和GS115/pPIC9K- ATLV218W在pH 7.0、40 ℃條件下的酶活分別達(dá)到0.075 U/mL和0.141 U/mL，較出發(fā)菌株GS115/pPIC9K-ATL的酶活分別提高了1.95倍和3.66倍。將發(fā)酵96 h時(shí)收集的發(fā)酵上清液進(jìn)行蛋白純化，得到純化的蛋白，并通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè) (圖4)。突變酶與野生型酶在蛋白分子量大小上沒(méi)有顯著區(qū)別，各樣品均呈現(xiàn)約44 kDa大小的條帶 (黑色箭頭所示)。將純化后的蛋白制備成約0.80 mg/mL蛋白濃度的酶液后，以-NPL為底物，在pH 7.0、40 ℃條件下，分別檢測(cè)突變酶和野生型酶的酶活。結(jié)果表明，ATLLid和ATLV218W對(duì)-NPL的水解活性與野生型相比顯著提高，比酶活分別為0.77 U/mg和1.32 U/mg，分別為野生型ATL活力 (0.34 U/mg) 2.26倍和3.38倍 (圖5)。因此，將對(duì)ATLLid和ATLV218W進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定和分析突變位點(diǎn)對(duì)蛋白催化活力影響的機(jī)制。

圖2 ANL Phe219和ATL Val218的氨基酸保守性分析

圖3 突變菌株的搖瓶發(fā)酵曲線(A：菌體濃度OD600；B：蛋白濃度；C：酶活)

2.3 突變酶和野生型酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 最適pH及pH穩(wěn)定性

如圖6所示，突變酶ATLLid和ATLV218W與野生型酶ATL的最適pH均為5.0，當(dāng)pH為2.0時(shí)酶迅速失活，酶活力幾乎為0。在堿性環(huán)境中，當(dāng)pH高于7.0，酶活力明顯下降，活力低于30%?？梢?jiàn)脂肪酶起水解活性作用的pH范圍較窄，一般在pH 4.5–6.0之間。如圖6所示，在pH 4.0–8.0范圍內(nèi)ATLLid、ATLV218W與ATL均具有較好的穩(wěn)定性，殘余活力保持在90%以上。當(dāng)在pH 3.0緩沖液中放置24 h后，ATLLid、ATLV218W和ATL分別殘留約78.26%、76.19%和72.19%的相對(duì)酶活，而在pH 2.0時(shí)，分別殘留45.07%、42.40%和33.86%的相對(duì)酶活。可見(jiàn)，ATL在畢赤酵母中重組表達(dá)后并沒(méi)有改變其耐酸的酶學(xué)特性[7]，且突變酶ATLLid和ATLV218W也同樣具有良好的耐酸特性。

如圖7A所示，突變酶ATLLid和ATLV218W的最適溫度為35 ℃，而原始酶ATL則在40 ℃時(shí)活性最高。當(dāng)溫度上升至40 ℃，ATLLid酶活迅速下降，僅保留52.53%左右，ATLV218W則仍保留88.46%的酶活；當(dāng)溫度高于40 ℃時(shí)，3種蛋白的酶活均迅速下降，并在60 ℃完全失活；當(dāng)溫度降為20 ℃，ATLLid和ATLV218W分別保留69.62%和76.67%的活力，而ATL僅保留18.69%的活力。由圖7可見(jiàn)，在20 ℃溫浴6.5 h后，ATLLid、ATLV218W和ATL分別保留了74.79%、84.51%和85.01%的殘存活力；在30 ℃溫浴6.5 h后，分別測(cè)得55.70%、55.84%和68.87%的相對(duì)酶活；在40 ℃溫浴6.5 h后，分別測(cè)得36.04%、40.85%和60.28%的相對(duì)酶活；而在50 ℃溫浴，酶活性均迅速下降，溫浴1 h后僅分別剩余6.77%、10.87%和11.69%的相對(duì)酶活。可見(jiàn)，突變使得ATL的最適溫度向低溫 (35 ℃) 略微偏移，對(duì)溫度的穩(wěn)定性也有所降低(ATLLid＜ATLV218W＜ATL)。

圖4 野生型脂肪酶ATL和突變型脂肪酶的SDS-PAGE圖

圖5 野生型脂肪酶與突變型脂肪酶的水解活性對(duì)比

圖6 pH對(duì)脂肪酶活力和穩(wěn)定性的影響

2.3.3 底物特異性

對(duì)酶活較高的突變酶ATLLid和ATLV218W進(jìn)行了底物碳鏈長(zhǎng)度特異性研究，并與野生型酶ATL進(jìn)行對(duì)比。如圖8所示，突變酶與野生型酶均對(duì)12個(gè)碳的對(duì)硝基苯酚月桂酸酯-NPL特異性最高。然而，ATLLid對(duì)C14-C16的相對(duì)酶活顯著高于ATLV218W和ATL，說(shuō)明ATLLid提高了對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸的底物特異性。該結(jié)果表明，ATL蓋子區(qū)域改造后可識(shí)別含長(zhǎng)鏈脂肪酸的底物并使其更好地結(jié)合到活性中心?？梢?jiàn)，脂肪酶的蓋子區(qū)域部分位點(diǎn)的改變會(huì)對(duì)酶的底物特異性產(chǎn)生影響，正如Santarossa等[20]將莓實(shí)假單胞菌脂肪酶的蓋子區(qū)域的Thr137和Thr138分別突變?yōu)閂al和Asp后顯示出了對(duì)不同碳鏈長(zhǎng)度底物的不同偏好性。

圖7 溫度對(duì)脂肪酶活力和穩(wěn)定性的影響

2.3.4 酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)

以對(duì)硝基苯酚酯-NPP和-NPL為底物，測(cè)定突變酶ATLLid和ATLV218W與野生型酶ATL的反應(yīng)動(dòng)力學(xué) (表2)。ATLLid對(duì)兩種底物-NPL和-NPP的m值從原來(lái)的0.15 mmol/L和0.73 mmol/L分別提高到了1.53 mmol/L和1.69 mmol/L，說(shuō)明突變的蓋子結(jié)構(gòu)阻礙底物進(jìn)入酶的活性中心，導(dǎo)致突變酶對(duì)底物的親和力變差，酶反應(yīng)所需的底物濃度增大。但是，脂肪酶的cat值卻比野生型酶分別提高了約39.37倍和9.55倍，催化活性顯著增強(qiáng)。由此，cat/m值分別提高了2.85倍和3.57倍，該結(jié)果表明酶的催化效率提高的主要原因是蓋子構(gòu)型的變化導(dǎo)致的酶活性中心催化能力的提高，但隨著對(duì)底物親和力的降低，會(huì)影響催化效率的提高程度。

圖8 突變型脂肪酶ATLLid、ATLV218W和野生型脂肪酶ATL的底物特異性

底物結(jié)合口袋域突變后，脂肪酶ATLV218W對(duì)兩種底物-NPL和-NPP的m值比野生型酶ATL分別提高了4.33倍和0.95倍，說(shuō)明將底物結(jié)合口袋域中的纈氨酸Val突變?yōu)樯彼酺rp后，對(duì)底物的親和力也顯著降低，酶反應(yīng)需要的底物濃度變大。然而，脂肪酶的cat值卻比野生型酶分別提高了約50.79倍和14.67倍，說(shuō)明突變影響了酶的活性中心與底物的相互作用，導(dǎo)致催化活性顯著增強(qiáng)。由此，cat/m值分別提高了8.48倍和7.01倍，該結(jié)果表明酶的催化效率提高的主要原因是底物結(jié)合口袋域構(gòu)型變化導(dǎo)致的酶活性中心催化能力的提高。

綜合上述兩種突變酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選定的突變位點(diǎn)雖然使得脂肪酶對(duì)底物的親和能力降低，但顯著提高了酶的催化速度，從而提高了脂肪酶的催化活性。

2.4 突變酶的結(jié)構(gòu)分析

本研究通過(guò)對(duì)ATL的蓋子區(qū)域和底物結(jié)合口袋域的部分位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到兩種對(duì)底物對(duì)硝基苯酚月桂酸酯-NPL的催化活性顯著提高的突變酶ATLLid和ATLV218W。通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)同源建模模擬及分子對(duì)接，分別分析導(dǎo)致ATLLid和ATLV218W對(duì)底物-NPL催化活性提高的原因。

2.4.1 突變酶ATLLid

解折疊自由能是蛋白質(zhì)折疊態(tài)和伸展態(tài)之間的吉布斯自由能差，反映的是蛋白質(zhì)解聚及解鏈過(guò)程中受到的氫鍵、范德華力、熵效應(yīng)等的綜合影響，是反映蛋白質(zhì)熱力學(xué)穩(wěn)定性的重要參數(shù)[21]。如圖1所示突變酶ATLLid的突變位點(diǎn)位于蓋子區(qū)域的前4個(gè)氨基酸，利用FoldX[22]預(yù)測(cè)突變結(jié)構(gòu)的解折疊自由能，得到的解折疊自由能差(ΔΔ) 約為–0.92 kcal/mol (ΔΔ=Δmutant–Δwild，ΔΔ>0代表正效應(yīng)，ΔΔ<0代表負(fù)效應(yīng)[21,23])，說(shuō)明蓋子區(qū)域的突變降低了整個(gè)結(jié)構(gòu)的解折疊自由能，可能在一定程度上提高了ATL蓋子區(qū)域的柔性，進(jìn)而使得底物更易進(jìn)入活性中心。

表2 野生型ATL與突變型酶ATLLid和ATLV218W動(dòng)力學(xué)參數(shù)

蛋白的親疏水相互作用是維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的重要因素，通常根據(jù)蛋白質(zhì)的總平均親水性 GRAVY值 (Grand average of hydropathy) 來(lái)預(yù)測(cè)疏水性的變化[24]。GRAVY值是指序列中所有氨基酸親水值的總和與氨基酸數(shù)量的比值，負(fù)值越大表示親水性越好，正值越大表示疏水性越強(qiáng)。通過(guò)Protparam工具(http://web.expasy.org/ protparam/)分析結(jié)果顯示，出發(fā)酶ATL的蓋子序列的GRAVY為–0.300，而突變酶ATLLid蓋子序列的GRAVY為0.050。這說(shuō)明突變后的ATLLid蓋子的疏水性增加，這可能導(dǎo)致蓋子與疏水性底物的親和力增加，底物進(jìn)入活性中心的阻力減小，從而催化效率提高。

利用PyMOL中的Mutagenesis模塊來(lái)構(gòu)建突變酶ATLLid的模擬結(jié)構(gòu)，并分別將ATL和ATLLid的開(kāi)蓋模擬結(jié)構(gòu)與-NPL進(jìn)行分子對(duì)接。如圖9所示，-NPL所結(jié)合的狹長(zhǎng)凹陷區(qū)域?yàn)榈孜锝Y(jié)合口袋區(qū)域，紅色代表催化活性中心，磚紅色為蓋子區(qū)域。突變酶ATLLid的底物結(jié)合口袋(圖9A) 與野生型 (圖9B) 相比，位于對(duì)硝基苯所在方向的口袋區(qū)域顯著增大，與野生型相比空間位阻減少 (黃色箭頭所示)，使對(duì)硝基苯酚酯類底物更好地進(jìn)入口袋并與活性中心結(jié)合，從而提高ATLLid對(duì)該類底物的偏好性。另外，ATLLid蓋子的疏水性增加，能夠更好地穩(wěn)定底物中疏水性長(zhǎng)鏈脂肪酸基團(tuán)，因此ATLLid對(duì)長(zhǎng)鏈底物如-NPL，催化活力更高。分子對(duì)接為ATLLid的底物特異性研究結(jié)果 (圖8) 提供了有力的證據(jù)。

2.4.2 突變酶ATLV218W

如圖10A所示，Val218處于Binding pocket 1 domain，位于β轉(zhuǎn)角，介于α螺旋與無(wú)規(guī)卷曲之間，其N端通過(guò)α螺旋與催化三聯(lián)體中的Asp208相連。使用PyMOL中的Mutagenesis模塊進(jìn)行虛擬突變，將218位點(diǎn)的V突變?yōu)閃后，該β轉(zhuǎn)角的二面角構(gòu)型發(fā)生變化，使得該區(qū)域的空間構(gòu)象發(fā)生改變，同時(shí)影響到Asp208的空間位置。如圖10所示，突變后，ATLV218W中Asp208與His265的間距由3.2 ? (圖10A) 縮短至2.8 ? (圖10B)，從而影響催化三聯(lián)體的整體構(gòu)象。由于催化三聯(lián)體的空間位置發(fā)生極小的改變都將會(huì)影響酶的催化活性，在本研究中ATLV218W對(duì)于底物-NPL的cat相比野生型提高了49.9倍。

圖9 ATLLid與ATL底物對(duì)接三維模擬圖

圖10 ATL的突變點(diǎn)Val218的三維結(jié)構(gòu)模擬圖

3 結(jié)論

綜上所述，本研究采用理性設(shè)計(jì)的方法，對(duì)來(lái)自的脂肪酶ATL的蓋子區(qū)域和底物結(jié)合口袋域中的位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到了對(duì)對(duì)硝基苯酚酯類底物催化活性顯著提高的兩種突變酶ATLLid和ATLV218W。利用同源建模模擬及分子對(duì)接等手段分析得出，ATLLid蓋子區(qū)域的突變可使蓋子柔性增強(qiáng)、疏水性提高和底物結(jié)合口袋變大，使得底物更易進(jìn)入催化活性中心，提高對(duì)長(zhǎng)鏈底物的催化活力。ATLV218W底物結(jié)合口袋域的突變則影響了催化三聯(lián)體中的Asp208的空間位置，進(jìn)而影響酶的催化活性。因此，本研究的后續(xù)工作將在此研究工作基礎(chǔ)上對(duì)蓋子區(qū)域和底物結(jié)合口袋域進(jìn)行飽和突變或組合突變，以期獲得催化活性更高的脂肪酶。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Improvement of catalytic activity oflipase by site-directed mutagenesis

Xiaofeng Zhang, Xiaowei Yu, and Yan Xu

The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

The catalytic activity oflipase (ATL) was improved by rational design. According to the sequence analysis and homologous modeling, several amino acids involved in the lid domain and substrate binding pocket domains of the acidic lipase ATL were mutated by site-directed mutagenesis, and eight mutants were constructed. These mutants and the wild type lipase ATL were expressed inGS115 and the enzymatic properties were characterized. The mutants ATLLid and ATLV218W exhibited higher hydrolytic activity than ATL towards-nitrophenyl laurate. Thecatvalues of ATLLid and ATLV218W towards-nitrophenyl laurate were 39.37- and 50.79-fold higher, and thecat/mvalues were 2.85- and 8.48-fold higher than the wild type, respectively. Although thermostability of these mutants decreased slightly, ATLLid and ATLV218W still exhibited the maximum activity at pH 5.0 and high stability in a broad range of pH (4.0–8.0), which were similar to the wild type. Using homologous modeling and molecular docking technology the mechanism for the improvement of catalytic activity was analyzed. These findings not only shed light on the relationship between the lid domain/substrate binding pocket domain and catalytic activity but also provided comprehensive scheme for further engineering to gain more efficient lipases.

lipase,, homologous modeling, site-directed mutagenesis, catalytic activity, molecular docking

January 24, 2018;

April 3, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31671799), Six Talent Peaks Project in Jiangsu Province (No. NY-010), 333 Project in Jiangsu Province (No. BRA2015316), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2012AA022207).

Xiaowei Yu. Tel/Fax: +86-510-85918201; E-mail: bioyuxw@aliyun.com

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 31671799)，江蘇省“六大人才高峰”項(xiàng)目 (No. NY-010)，江蘇省“333工程”項(xiàng)目 (No. BRA2015316)，國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2012AA022207) 資助。

10.13345/j.cjb.180040

2018-04-25

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20180424.1007.002.html