姜淑喆，李凈凈，曹春靜，申玉龍，倪金鳳

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黃翅大白蟻來源β-葡萄糖苷酶的分子改造

姜淑喆，李凈凈，曹春靜，申玉龍，倪金鳳

山東大學(xué) 微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100

金城. 2018酶工程?？蜓? 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(7): 1021?1023.Jin C. Preface for special issue on enzyme engineering (2018). Chin J Biotech, 2018, 34(7): 1021?1023.

纖維素水解成為葡萄糖需要一系列纖維素酶的作用，其中β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases) 起著至關(guān)重要的作用。來自于培菌白蟻中腸的β-葡萄糖苷酶(MbmgBG1) 具有較高的葡萄糖耐受性(1.5 mol/L的葡萄糖，保持60%以上的酶活力)，但是，酶活力低和熱穩(wěn)定性差限制了β-葡萄糖苷酶(MbmgBG1) 在食品以及工業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。因此通過對(duì)保守氨基酸附近的非保守氨基酸定點(diǎn)突變，獲得點(diǎn)突變體(F167L、T176C、E347I、R354K、N393G和V425M)，其中突變體F167L、R354K的比活力(底物pNPG) 比MbmgBG1分別高出約2倍和4倍。突變體的cat/m值比野生型大，反映了突變體對(duì)底物的親和力以及催化能力比MbmgBG1強(qiáng)。當(dāng)酶活力保留60%以上時(shí)，MbmgBG1所耐受的葡萄糖濃度為1.5 mol/L，而F167L為2.0 mol/L，R354K為3.0 mol/L。這些特性的增強(qiáng)表明，對(duì)活性中心附近保守區(qū)域內(nèi)的非保守氨基酸突變，可以較大程度地影響活性，因此需要更深入地研究β-葡萄糖苷酶的活性中心位點(diǎn)，進(jìn)行改造以提高催化效率。

β-葡萄糖苷酶，點(diǎn)突變，動(dòng)力學(xué)常數(shù)，葡萄糖耐受性

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，是自然界中最豐富的多糖之一，也是生物能源取之不盡用之不竭的來源。纖維素水解成為葡萄糖，需要一系列纖維素酶的作用，根據(jù)纖維素酶的作用方式和底物特異性的不同，主要分為三大類：內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶 (EGs，EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶 (CBHs，EC 3.2.1.91) 和β-葡萄糖苷酶 (BGs，EC 3.2.1.21)[1]。其中β-葡萄糖苷酶的作用是降解纖維寡糖產(chǎn)生葡萄糖，因此β-葡萄糖苷酶可以緩解內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的產(chǎn)物抑制，所以β-葡萄糖苷酶起著至關(guān)重要的作用，被認(rèn)為是限速酶，是酶法降解天然纖維素材料的瓶頸。因此，很多人都在致力于尋找酶學(xué)性質(zhì)較好的β-葡萄糖苷酶來應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)[2]。

雖然在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中可以找到許多β-葡萄糖苷酶，但是酶活高、熱穩(wěn)定性好、葡萄糖耐受性高的卻很少。例如，Novozym 188已經(jīng)作為一種商業(yè)酶供工業(yè)生產(chǎn)使用，但是它的葡萄糖耐受能力很低 (i為0.1 mol/L)；另外來源于高山象白蟻前腸唾液腺的β-葡萄糖苷酶 (G1mgNtBG1)，擁有較好的熱穩(wěn)定性，但低的酶活力和葡萄糖耐受性 (i為0.6 mol/L) 卻限制了它的工業(yè)化應(yīng)用[3]。在前期研究中，我們實(shí)驗(yàn)室從高等培菌白蟻黃翅大白蟻中腸克隆了一個(gè)具有較高葡萄糖耐受性的β-葡萄糖苷酶基因。該β-葡萄糖苷酶分子量56 kDa[4]，屬于糖苷水解酶GH1家族。其葡萄糖耐受性高，但酶活力和熱穩(wěn)定性不理想。我們試圖對(duì)其改造以獲得更好特性的β-葡萄糖苷酶。

碳水化合物活性酶 (CAZy) 數(shù)據(jù)庫[5]顯示出有17 108個(gè) (截至于2017年12月01日) GH1家族的酶，其中有336個(gè)酶進(jìn)行了生物學(xué)分析。53個(gè)酶的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析 (40個(gè)屬于GH1家族的β-葡萄糖苷酶)，這些數(shù)據(jù)為分析改造MbmgBG1奠定了理論基礎(chǔ)[6]。近年來，很多學(xué)者成功進(jìn)行了β-葡萄糖苷酶的改造[7-8]。例如，從吐魯番盆地土壤的宏基因組中得到的β-葡萄糖苷酶 (Bgl6)[2]，具有較高的葡萄糖耐受性和酶活力，但是熱穩(wěn)定性差，通過定點(diǎn)突變獲得優(yōu)質(zhì)突變體M3，在葡萄糖耐受性幾乎不受影響的情況下其熱穩(wěn)定性得到了提高[2,9]，為我們改造MbmgBG1奠定了實(shí)踐基礎(chǔ)。文中我們通過分析同源建模得到的MbmgBG1的三維結(jié)構(gòu)，選擇保守氨基酸附近的非保守氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，研究這些氨基酸對(duì)MbmgBG1酶學(xué)特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器

CelLytic B Cell Lysis Reagent、對(duì)硝基苯基- β-D-吡喃葡萄糖苷 (pNPG) 購自Sigma公司；MagExtract His-tag fusion protein purification kit 購自日本Toyobo公司；DNA Ladder、限制性內(nèi)切酶、Eazy酶、DNA Ligation Kit均購自TaKaRa公司；Cycle Pure Kit、Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit 購自O(shè)MEGA公司；Ni-NTA瓊脂糖樹脂、氨芐青霉素購自Invitrogen公司；異丙基- β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 購買自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；纖維二糖(Cellobiose) 購自國藥公司；蛋白胨和酵母粉購自O(shè)XOID公司；其他均購買自國藥公司。

PCR儀 (TaKaRa)；酶標(biāo)儀 (TECAN SUNRISE M200CHB-202)；凝膠成像儀 (UV Itec公司)；2802H UV/VIS分光光度計(jì) (UNICO)；PHS-3C精密pH計(jì) (上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：10.0 g蛋白胨，5.0 g酵母粉，10.0 g NaCl，20.0 g的瓊脂粉溶于1 000 mL蒸餾水。121 ℃條件下滅菌20 min。冷卻至55 ℃左右，加入氨芐青霉素 (終濃度100 μg/mL)，成為LA培養(yǎng)基。

鑒定培養(yǎng)基：10.0 g蛋白胨，5.0 g酵母粉，10.0 g NaCl，2.0 g七葉苷，20.0 g瓊脂。溶于1 000 mL蒸餾水。121 ℃條件下滅菌20 min。冷卻至55 ℃，加入氨芐青霉素 (終濃度100 μg/mL)、檸檬酸鐵銨 (0.5%) 和IPTG (1 mmol/L)[2]。

1.1.3 菌株及質(zhì)粒

大腸桿菌JM109、表達(dá)載體pQE-30、黃翅大白蟻中腸來源的β-葡萄糖苷酶基因MbmgBG1為實(shí)驗(yàn)室保存，pQE-30通用引物以及實(shí)驗(yàn)過程中所有引物由華大基因測序公司合成。

1.2 構(gòu)建突變體表達(dá)載體

以MbmgBG1為模板，MbmgBG1-forward/ MbmgBG1-reverse和D53K-forward/D53K-reverse為引物 (表1)，利用重疊延伸PCR擴(kuò)增出突變位點(diǎn)為D53K的片段。利用Ⅰ和Ⅰ雙酶切后連接，構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆進(jìn)行測序鑒定，并命名為pQE30-MbmgBG1D53K。按照上述突變體D53K的構(gòu)建方法，構(gòu)建點(diǎn)突變體F167L、T176C、E347I、R354K、N393G和V425M。

1.3 誘導(dǎo)表達(dá)

在平板上分別挑取突變體和野生型的單克隆，接種于5 mL LA培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)過夜。按1%的接種量接種于20 mL LA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至600為0.6?0.8時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，16 ℃、180 r/min進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)16 h[10]。4 ℃、10 000 r/min離心5 min收集菌體，利用破壁緩沖液 (50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl) 洗滌菌體2次，將菌體?20 ℃凍存或立即破壁。向菌體中加入1 mL破壁緩沖液重懸菌體，超聲波破壁 (功率400 W，超聲時(shí)間5 s，間隔時(shí)間5 s，超聲次數(shù)100 cycles)。高速離心收集上清 (12 000 r/min，4 ℃，10 min)，即為粗酶液[11]。

表1 PCR引物序列

Underlines indicate restriction enzyme sites.

1.4 純化

利用親和層析原理純化含有組氨酸標(biāo)簽的蛋白，具體步驟參照文獻(xiàn)[4]，純化后的蛋白在4 ℃下浸沒在透析液 (50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl，0.1 mmol/L EDTA) 中過夜，去除酶液中的咪唑，用于酶活分析。

1.5 酶活力測定方法

1.5.1 以pNPG為底物活性的測定

以0.1 mol/L的醋酸鈉緩沖液配制5 mmol/L的對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷 (pNPG) 作為底物，取200 μL底物與50 μL適當(dāng)稀釋的酶液，充分混合后，37 ℃恒溫條件下反應(yīng)30 min。結(jié)束后加入1 mL 0.6 mol/L的Na2CO3終止反應(yīng)。410測定吸光值，做3個(gè)平行[12]。每分鐘產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位U。

1.5.2 以纖維二糖為底物活性的測定[13]

以0.1 mol/L的醋酸鈉緩沖液配制2%的纖維二糖 (Cellobiose) 作為底物，取200 μL底物與50 μL適當(dāng)稀釋的酶液，充分混合后，37 ℃恒溫條件下反應(yīng)30 min。結(jié)束后沸水浴5 min，立即冰水中冷卻2–3 min后加入1 mL POD-GOD (葡萄糖氧化酶)，37 ℃恒溫條件下反應(yīng)10 min，冰上終止反應(yīng)。505測定吸光值，做3個(gè)平行。每分鐘產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位U。

1.5.3 反應(yīng)溫度和pH影響的測定[12]

最適溫度：以5 mmol/L的pNPG為底物，按照1.5.1酶活力測定步驟，以5 ℃為間隔，在30–70 ℃范圍內(nèi)測定β-葡萄糖苷酶的酶活。

最適pH：用0.1 mol/L醋酸緩沖液配制pH 3.0– 6.5的2%的纖維二糖，用0.1 mol/L磷酸緩沖液配制pH 6.5–7.0的2%的纖維二糖，用0.1 mol/L Tris-HCl配制pH 7.5–9.0的2%的纖維二糖。不同pH間隔0.5，按照1.5.2酶活力測定方法，在37 ℃、不同pH值下的酶活。

溫度穩(wěn)定性：以5 mmol/L的pNPG為底物，在30–70 ℃范圍內(nèi)，以5 ℃為間隔，將酶液在不同溫度下處理30 min，按照1.5.1酶活力測定步驟測定β-葡萄糖苷酶的剩余酶活力。

pH穩(wěn)定性：測定pH 3.0–8.0 (Mcilavine buffer)[12]范圍內(nèi)，以0.5為間隔，將酶液在25 ℃、不同pH下處理30 min，按照1.5.2酶活力測定步驟測定β-葡萄糖苷酶的剩余酶活力。

1.5.4 葡萄糖耐受性的測定

利用0.1 mol/L醋酸緩沖液配制含有不同葡萄糖濃度的 (0–4.0 mol/L范圍內(nèi)) 5 mmol/L的pNPG作為底物，測定β-葡萄糖苷酶的酶活力，測定方法同1.5.1[11]。

1.5.5 動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測定

利用0.1 mol/L的醋酸鈉緩沖液配置一系列不同濃度 (0.4–20 mmol/L) 的pNPG為底物，測定β-葡萄糖苷酶的酶活。利用底物濃度和對(duì)應(yīng)酶活力，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法得到m和max值[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 同源建模和突變體的選擇

已有文獻(xiàn)報(bào)道出很多已知三維結(jié)構(gòu)的GH1家族的β-葡萄糖苷酶，其典型結(jié)構(gòu)是由8個(gè) (α/β) 結(jié)構(gòu)圍成的桶狀結(jié)構(gòu)，也被稱為4/7超家族[14-15]。將白蟻的β-葡萄糖苷酶MbmgBG1進(jìn)行Blast氨基酸序列比對(duì)，同源性最高的是恒春新白蟻來源的β-葡萄糖苷酶 (NkBG，PBD數(shù)據(jù)庫，3vif，ID：BAB91145.1)[16]，以它的三維結(jié)構(gòu)為模板，由SWISS-MODEL同源建模，得到MbmgBG1的三維結(jié)構(gòu)圖 (圖1A)[17]。

圖1 同源建模 (SWISS-MODEL) MbmgBG1的三維結(jié)構(gòu)

在PyMOL中打開MbmgBG1的三維結(jié)構(gòu)圖，用不同的顏色展示出典型結(jié)構(gòu)中的8個(gè) (α/β) 結(jié)構(gòu)，用紅色標(biāo)注出酶的催化殘基，其他顏色標(biāo)注出酶活中心表面的保守氨基酸殘基 (圖1A)。

通過同源建模得到MbmgBG1的三維結(jié)構(gòu)，分析它的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，以及保守氨基酸的催化功能和非保守氨基酸對(duì)酶活中心的影響[15]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，改變距離酶活力中心較近的點(diǎn)，能較大影響酶活力[18]。Young曾提出突變距離酶活位點(diǎn)5 ?之內(nèi)的氨基酸容易造成酶的完全失活；一般改變距離活性位點(diǎn)5–10 ?范圍內(nèi)的氨基酸殘基，能得到較理想的突變體。通過與已報(bào)道的酶活力較高、熱穩(wěn)定性較好的GH1家族的β-葡萄糖苷酶的多序列比對(duì)[2-3,19]，確定突變原則為，尋找保守區(qū)內(nèi)的非保守序列，突變酶活中心附近的非保守氨基酸[18,20]。

2.2 突變體酶活分析

選擇保守氨基酸附近的非保守氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到D53K、F167L、T176C、E347I、R354K、N393G以及V425M共7個(gè)突變體(圖2)。其中突變體F167L、R354K的酶活與野生型相比有明顯提高，突變體F167L的酶活提高約2倍，突變體R354K的酶活提高約4倍。突變體D53K、N393G和V425M的酶活力基本沒有改變。突變體T176C、E347I比野生型的酶活降低。熱穩(wěn)定性都沒有得到改善。

圖2 野生型與突變體的酶活力

7株突變體中，只有突變體F167L和R354K的比活力有明顯提高，對(duì)這兩個(gè)突變體的酶學(xué)動(dòng)力學(xué)常數(shù)進(jìn)行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)F167L和R354K的m值都有不同程度的減小 (表2)，預(yù)示突變體F167L和R354K擁有比野生型MbmgBG1較好的底物親和力。cat/m比值變大，突變體F167L和R354K比野生型分別增加了5.79倍和3.48倍，這反映了突變體對(duì)底物的親和力和催化能力比MbmgBG1要好，降解底物的能力增強(qiáng)[21]。

2.3 突變位點(diǎn)對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

測定溫度對(duì)突變體活性的影響。野生型的最適溫度在50 ℃左右，突變體R354K并沒有發(fā)生改變，突變體F167L發(fā)生了改變，最適溫度在45 ℃左右，而且最適溫度范圍也變窄了，在35–50 ℃范圍內(nèi)能保留80%以上的酶活力 (圖3A)。突變體的熱穩(wěn)定性幾乎和野生型保持一致，野生型和突變體在低溫時(shí) (<35 ℃) 的穩(wěn)定性較好，酶活損失較少，剩余酶活都在90%以上。35 ℃以上，隨著溫度的升高，酶活急劇下降，55 ℃時(shí)剩余酶活在20%左右 (圖3B)。突變體的熱穩(wěn)定性沒有得到改善。

表2 野生型MbmgBG1與突變體F167L、R354K的動(dòng)力學(xué)常數(shù)

Thecatandmvalues were determined on the basis of the Michaelis-Menten equation.

pH對(duì)突變體活性的影響。突變體的最適pH發(fā)生了不同程度的變化，野生型在pH為5.5時(shí)，酶活最高。突變體F167L和R354K分別在pH為4.5和5.0時(shí)，酶活最高。而且突變體R354K的最適反應(yīng)pH的范圍變寬，在pH為4.0?6.0時(shí)剩余酶活約在80%以上 (圖3C)。突變體和野生型的pH穩(wěn)定性幾乎保持一致。在pH為4.5?6.5時(shí)具有較高的酶活，酶的穩(wěn)定性比較好，pH為5.0保存時(shí)，酶的穩(wěn)定性最好 (圖3D)。

2.4 葡萄糖耐受性

葡萄糖耐受性的結(jié)果如圖4所示，突變體F167L和R354K的葡萄糖耐受性都比野生型的高。在反應(yīng)液中含有濃度為2.0 mol/L葡萄糖時(shí)，野生型的剩余酶活約在40%，突變體F167L的剩余酶活約在60%，而R354K的酶活還能維持在100%左右。還有一點(diǎn)值得注意的是，低濃度的葡萄糖對(duì)野生型和突變體的酶活都存在一定的促進(jìn)作用[2,9]。這種低葡萄糖濃度促進(jìn)、高葡萄糖濃度抑制的特點(diǎn)是糖苷水解酶1家族的β-葡萄糖苷酶所特有的，而糖苷水解酶3家族中的β-葡萄糖苷酶至今沒有發(fā)現(xiàn)此特點(diǎn)[22]。

3 討論

分析MbmgBG1三維結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，及保守氨基酸的催化功能和非保守氨基酸對(duì)酶活中心的影響，選擇7個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行點(diǎn)突變，獲得了點(diǎn)突變體。

β-葡萄糖苷酶MbmgBG1的Blast氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，在高度保守的區(qū)域里是Phe167，與恒春新白蟻的β-葡萄糖苷酶 (Leu) 不同[19-20,23]，而恒春新白蟻的β-葡萄糖苷酶具有較高的酶活力，所以將167位點(diǎn)的苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼?。在作用原理上來講，亮氨酸的疏水性較苯丙氨酸弱，增強(qiáng)了活性中心附近的親水性，可能更容易與底物結(jié)合，促進(jìn)產(chǎn)物釋放[16,24]。從結(jié)構(gòu)上來看(圖5A)，Phe167處在β折疊與loop區(qū)的交界處，距離活性中心較近[18]，突變?yōu)榱涟彼?，?dǎo)致催化殘基 (Glu173和Glu380) 與葡萄糖結(jié)合位點(diǎn) (Trp422) 的距離增加，而且構(gòu)象上發(fā)生一定的變化，使酶活力中心的空間變大，可以更好地釋放葡萄糖，從而導(dǎo)致酶活性增加。

圖3 溫度和pH對(duì)野生型和突變體酶活性與穩(wěn)定性的影響

圖4 野生型和突變體的葡萄糖耐受性

對(duì)于突變體R354K，是因?yàn)锳rg354位于酶活性中心的入口處 (圖5B)，還處于文獻(xiàn)報(bào)道的葡萄糖第二結(jié)合位點(diǎn)附近[9]，所以將R基較大的精氨酸突變?yōu)镽基較小的賴氨酸，這樣可能更利于底物的進(jìn)入和產(chǎn)物的釋放[17]，從而提高其酶活和葡萄糖耐受性。由精氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，降低了酶的pI值，可能是突變體R354K的最適pH變小的原因。另外，從結(jié)構(gòu)上來看，Arg354這一位點(diǎn)的突變并沒有引起酶活中心保守氨基酸殘基的改變。要完全解釋突變體R354K不同于野生型的原因，可能還需要更加深入的研究。

突變體D53K (圖5C)，因?yàn)锳sp53位于loop區(qū)，靈活性較大，導(dǎo)致β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性較差，希望突變?yōu)橘嚢彼幔軠p小其靈活性從而增強(qiáng)其熱穩(wěn)定性，但其酶活力和熱穩(wěn)定性都幾乎沒變，可能是因?yàn)锳sp53位于酶表面的loop區(qū)對(duì)酶活中心的影響較小。突變體N393G (圖5C)[24]，可能是因?yàn)樘於０泛捅彼岫际怯H水性氨基酸，雖然親水能力不同，但是Asn393位點(diǎn)距離酶活中心較遠(yuǎn)，對(duì)酶活中心的影響不大。突變體V425M (圖5C)，突變原因同F(xiàn)167L[19-20]，但可能Val425位于距離酶活中心較近的loop區(qū)位置(圖5C)，疏水性的纈氨酸突變?yōu)槭杷缘募琢虬彼釋?duì)酶活中心的影響不大。所以D53K、N393G和V425M的酶活力幾乎不變。

對(duì)于突變體T176C[2](圖5D) 酶活降低的原因，可能是因?yàn)橥蛔凕c(diǎn)Thr176位于酶活中心，距離催化殘基較近，對(duì)催化作用影響較大。也可能由蘇氨酸突變?yōu)榘腚装彼嵋肓肆蛟?，與其他含有硫元素的半胱氨酸或甲硫氨酸形成異常的二硫鍵，影響蛋白正常結(jié)構(gòu)的形成，導(dǎo)致酶活力大大降低，當(dāng)然，這一點(diǎn)還需要結(jié)構(gòu)上的進(jìn)一步驗(yàn)證。對(duì)于突變體E347I (圖5D)[15]，由親水性的谷氨酸突變?yōu)槭杷缘漠惲涟彼?，增?qiáng)β-葡萄糖苷酶表面的疏水性，希望得到熱穩(wěn)定性較好的β-葡萄糖苷酶，但是可能太大程度地影響了酶分子，使酶活降低。

圖5 MbmgBG1和突變體的活性位點(diǎn)和配體結(jié)構(gòu)

Young曾提出突變距離酶活中心位點(diǎn)5 ?之內(nèi)的氨基酸容易造成酶的完全失活，對(duì)于距離催化殘基較近且位于酶活中心表面的Leu175和Asn233這兩個(gè)位點(diǎn)[25]，還有待于進(jìn)一步確認(rèn)其酶活力是否完全喪失[26]。距離酶活中心較近的氨基酸殘基都很大程度上影響酶活力，如底物入口處有糖苷配基的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)及其附近的一些間接影響酶活力的氨基酸殘基 (圖1)。

通過定點(diǎn)突變，我們獲得了兩個(gè)酶活較高、葡萄糖耐受性較強(qiáng)的突變體，為黃翅大白蟻中腸來源的β-葡萄糖苷酶進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。但是，突變體的熱穩(wěn)定性并沒有提高，接下來可以采用其他策略提高突變體的熱穩(wěn)定性。例如，利用SpyTag/SpyCatcher環(huán)化策略[27]提高酶的穩(wěn)定性，即根據(jù)各種酶的特定結(jié)構(gòu)進(jìn)行N-端和C-端的連接使其環(huán)化；或者通過酶剩余電荷的優(yōu)化 (優(yōu)化電荷相互作用) 進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)突變[28]，從而使酶的電勢 (E) 降低，熱穩(wěn)定性增強(qiáng)。

[1] Woodward J, Wiseman A. Fungal and other β-D-glucosidases their properties and applications. Enzyme Microb Technol, 1982, 4(2): 73–79.

[2] Cao LC, Wang ZJ, Ren GH, et al. Engineering a novel glucose-tolerant β-glucosidase as supplementation to enhance the hydrolysis of sugarcane bagasse at high glucose concentration. Biotechnol Biofuels, 2015, 8: 202–213.

[3] Uchima CA, Tokuda G, Watanabe H, et al. Heterologous expression inand characterization of an endogenous thermostable and high-glucose-tolerant β-glucosidase from the termite. Appl Environ Microb, 2012, 78(12): 4288–4293.

[4] Wu Y, Chi S, Yun C, et al. Molecular cloning and characterization of an endogenous digestive β-glucosidase from the midgut of the fungus-growing termite. Insect Mol Biol, 2012, 21(6): 604–614.

[5] Cantarel BL, Coutinho PM, Rancurel C, et al. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for glycogenomics. Nucleic Acids Res, 2009, 37(S1): D233–D238.

[6] Singh G, Verma AK, Kumar V. Catalytic properties, functional attributes and industrial applications of β-glucosidases. 3 Biotech, 2015, 6: 3–16.

[7] Biot-Pelletier D, Martin VJJ. Evolutionary engineering by genome shuffling. Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98(9): 3877–3887.

[8] Singhania RR, Patel AK, Pandey A, et al. Genetic modification: A tool for enhancing β-glucosidase production for biofuel application. Bioresource Technol, 2017, 245: 1352–1361.

[9] Pang PJ, Cao LC, Liu YH, et al. Structures of a glucose-tolerant β-glucosidase provide insights into its mechanism. J Struct Biol, 2017, 198(3): 154–162.

[10] Dong WL, Xue ML, Zhang Y, et al. Characterization of a β-glucosidase fromspecies and its application for succinic acid production from sugarcane bagasse hydrolysate. Bioresource Technol, 2017, 241: 309–316.

[11] Li YD, Liu N, Yang H, et al. Cloning and characterization of a new β-glucosidase from a metagenomic library of Rumen of cattle feeding with.BMC Biotechnol, 2014, 14: 85–93.

[12] Riou C, Salmon JM, Vallier MJ, et al. Purification, characterization, and substrate specificity of a novel highly glucose-tolerant β-glucosidase from. Appl Environ Microb, 1998, 64(10): 3607–3614.

[13] Yang F, Yang XF, Li Z, et al. Overexpression and characterization of a glucose-tolerant β-glucosidase from.with high specific activity for cellobiose. Appl Microbiol Biotechnol, 2015, 99(21): 8903–8915.

[14] Santos CA, Zanphorlin LM, Crucello A, et al. Crystal structure and biochemical characterization of the recombinant ThBgl, a GH1 β-glucosidase overexpressed inunder biomass degradation conditions. Biotechnol Biofuels, 2016, 9(1): 71–81.

[15] Czjzek M, Cicek M, Zamboni V, et al. The mechanism of substrate (aglycone) specificity in β-glucosidases is revealed by crystal structures of mutant maize β-glucosidase-DIMBOA, -DIMBOAGlc, and -dhurrin complexes. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(25): 13555–13560.

[16] Jeng WY, Wang NC, Lin CT, et al. High resolution structures ofβ-glucosidase mutants provide insights into the catalytic mechanism and the synthesis of glucoconjugates. Acta Crystallogr D, 2012, 68(7): 829–838.

[17] Sathe SS, Soni S, Ranvir VP, et al. Heterologous expression and biochemical studies of a thermostable glucose tolerant β-glucosidase from(bath strain). Int J Biol Macromol, 2017, 102: 805–812.

[18] Xie Y, An J, Yang GY, et al. Enhanced enzyme kinetic stability by increasing rigidity within the active site. J Biol Chem, 2014, 289(11): 7994–8006.

[19] Ni JF, Tokuda G, Takehara M, et al. Heterologous expression and enzymatic characterization of β-glucosidase from the drywood-eating termite,. Appl Entomol Zool, 2007, 42(3): 457–463.

[20] Tiwari R, Kumar K, Singh S, et al. Molecular detection and environment-specific diversity of glycosyl hydrolase family 1 β-glucosidase in different habitats. Front Microbiol, 2016, 7: 1597.

[21] Miao LL, Fan HX, Qu J, et al. Specific amino acids responsible for the cold adaptedness ofβ-glucosidase BglU. Appl Microbiol Biotechnol, 2017, 101(5): 2033–2041.

[22] de Giuseppe PO, Souza TDCB, Souza FHM, et al. Structural basis for glucose tolerance in GH1 β-glucosidases. Acta Crystallogr D, 2014, 70(6): 1631–1639.

[23] Chandrasekharaiah M, Thulasi A, Bagath M, et al. Molecular cloning, expression and characterization of a novel feruloyl esterase enzyme from the symbionts of termite () gut. BMB Rep, 2011, 44(1): 52–57.

[24] Kulkarni TS, Khan S, Villagomez R, et al. Crystal structure of β-glucosidase 1A fromand comparison of active site mutants for hydrolysis of flavonoid glucosides. Proteins, 2017, 85(5): 872–884.

[25] Hassan N, Nguyen TH, Intanon M, et al. Biochemical and structural characterization of a thermostable β-glucosidase fromfor galacto-oligosaccharide synthesis. Appl Microbiol Biotechnol, 2015, 99(4): 1731–1744.

[26] Hassan N, Geiger B, Gandini R, et al. Engineering a thermostableβ-glucosidase for improved galacto-oligosaccharide synthesis. Appl Microbiol Biotechnol, 2016, 100(8): 3533–3543.

[27] Wang JD, Wang YL, Wang XZ, et al. Enhanced thermal stability of lichenase from168 by SpyTag/SpyCatcher-mediated spontaneous cyclization. Biotechnol Biofuels, 2016, 9: 79–87.

[28] You S, Tu T, Zhang LJ, et al. Improvement of the thermostability and catalytic efficiency of a highly active β-glucanase fromJCM12802 by optimizing residual charge-charge interactions. Biotechnol Biofuels, 2016, 9: 124–135.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Molecular modification of β-glucosidase from the midgut of

Shuzhe Jiang, Jingjing Li, Chunjing Cao, Yulong Shen, and Jinfeng Ni

State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Ji’nan 250100, Shandong, China

Cellulose hydrolysis to glucose requires a series of cellulase enzymes, of which β-glucosidases play a crucial role. β-glucosidase (MbmgBG1) derived from the midgut ofhas higher glucose tolerance (maintaining more than 60% enzyme activity at 1.5 mol/L glucose). However, low enzyme activity and poor thermal stability limit the applications of β-glucosidase in food industries. Point mutants (F167L, T176C, E347I, R354K, N393G and V425M) were obtained by site-directed mutagenesis of non-conserved amino acids near conserved amino acids. Among them, the specific activities against to substrate pNPG of two mutants (F167L and R354K) were about 2-fold and 4-fold higher than that of MbmgBG1.cat/mvalues were also higher than that of the wild-type, reflecting stronger affinity to the substrate and higher catalytic ability of mutants than MbmgBG1. When the glucose concentration was 1.5 mol/L, the enzyme activity of MbmgBG1 was about 60% of the original activity. F167L and R354K kept 60% enzymatic activity when the glucose concentrations of was 2.0 mol/L and 3.0 mol/L, respectively. These results lay a foundation for further studies on the catalytic efficiency of β-glucosidase.

β-glucosidase, site-directed mutagenesis, kinetic constant, glucose tolerance

December 25, 2017;

February 5, 2018

National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (No. 2011CB707402), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31272370, 30870085).

10.13345/j.cjb.170511

Jinfeng Ni. Tel/Fax: +86-531-88363323; E-mail: jinfgni@sdu.edu.cn

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2011CB707402)，國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31272370, 30870085) 資助。