季曉微， 王 琳， 徐 軍， 劉素英， 董 曦

復旦大學附屬中山醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，上海 200032

卵巢癌已成為目前威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一。卵巢癌早期發(fā)病隱匿，缺乏特異性高的診斷技術，超過70%的患者在確診時已處于晚期；并且其侵襲速度快、復發(fā)率高，患者的5年生存率低于30%[1]。因此，探索特異性強、靈敏度高的診療靶點成為目前亟待解決的熱點問題。

MicroRNA(miRNA)是一類具有調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄水平的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，能通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)特異性結(jié)合，抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，實現(xiàn)對功能基因表達的調(diào)控，從而參與多種腫瘤細胞增殖和侵襲等惡性生物學行為的調(diào)控[2]。研究證實，miRNA-29b是一種能夠發(fā)揮抑癌作用的microRNA分子。目前已經(jīng)在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)miRNA-29b的表達異常下降，包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤等多種腫瘤[3-4]。因此，本研究擬觀察miRNA-29b對人卵巢癌細胞增殖的調(diào)控作用及其分子機制，旨在為卵巢癌的早期診斷和靶向治療提供潛在的靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 人卵巢癌上皮細胞系SKOV-3及人正常卵巢上皮細胞系IOSE80購自美國ATCC細胞庫；細胞培養(yǎng)試劑(DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、鏈霉素青霉素、胰蛋白酶)購自美國Gibco公司；細胞增殖活性檢測試劑盒Cell Counting Kit-8購自日本同仁化學研究所；ECL化學發(fā)光試劑和BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；miRNA提取試劑盒、miRNA反轉(zhuǎn)錄和熒光定量試劑盒、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒均購自美國Invitrogen公司；miRNA-29b mimic、mimic control miRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，miRNA-29b和U6引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計合成，其他常用生化試劑購自美國Sigma公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 人卵巢癌上皮細胞系SKOV-3及人正常卵巢上皮細胞系IOSE80復蘇后，使用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，恒溫細胞培養(yǎng)箱條件為37℃、5% CO2，每天更換1次培養(yǎng)基，細胞融合度>80%進行消化、傳代和接種，用于后續(xù)研究。

1.3 miRNA-29b表達水平的檢測 采用real-time PCR檢測SKOV-3細胞和IOSE80細胞中miRNA-29b表達水平。收集對數(shù)生長期SKOV-3細胞和IOSE80細胞，使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑進行反轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，使用熒光定量試劑進行定量，miRNA-29b表達檢測使用U6作為內(nèi)參。miRNA-29b相對表達按照2-ΔΔCt進行計算。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染 處于對數(shù)生長期的SKOV-3細胞消化收集，按照106/孔的密度接種于六孔板中，經(jīng)過24 h培養(yǎng)后，使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑按照試劑盒操作方案將miRNA-29b mimic和mimic control miRNA分別轉(zhuǎn)染到SKOV-3細胞中。將細胞分為空白組(Blank)、陰性對照組(Negative control)及miRNA-29b轉(zhuǎn)染組(miRNA-29b)。

1.5 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8試劑檢測SKOV-3細胞增殖能力，收集對數(shù)生長期的細胞，按照104/孔的密度接種于96孔板，細胞分組同上述3組，實驗操作按照CCK-8試劑盒進行，采用全自動酶標儀檢測光密度(D490)值，計算各組細胞增殖能力。

1.6 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell法檢測miRNA-29b轉(zhuǎn)染對SKOV-3細胞侵襲能力的影響。使用濃度為1 mg /mL的Matrigel膠體提前將Transwell培養(yǎng)板的上室進行包被，下室加入DMEM培養(yǎng)基，正常培養(yǎng)24 h后取出，放置于顯微鏡下隨機選取視野進行計數(shù)。

1.7 細胞蛋白表達水平檢測 采用Western 印跡法檢測細胞中蛋白的表達水平。細胞分組同上，使用RIPA細胞裂解液裂解細胞得到總蛋白，使用BCA法進行蛋白濃度定量，使用SDS-PAGE進行蛋白電泳，使用PVDF膜進行電轉(zhuǎn)，經(jīng)4℃封閉過夜，次日使用相應二抗孵育后通過ECL試劑進行化學發(fā)光，定量檢測目標蛋白表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA-29b在不同細胞中的表達差異 結(jié)果(圖1)顯示：人卵巢癌上皮細胞系SKOV-3細胞中miRNA-29b的表達顯著下降，與人正常卵巢上皮細胞系IOSE80細胞差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖1 不同細胞中miRNA-29b的相對表達水平

2.2 miRNA-29b mimic轉(zhuǎn)染對SKOV3細胞增殖能力的影響 結(jié)果(圖2)表明：SKOV3細胞轉(zhuǎn)染miRNA-29b mimic后，細胞中miRNA-29b的表達上調(diào)，與陰性對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。CCK-8法檢測結(jié)果(圖3)顯示：轉(zhuǎn)染miRNA-29b組SKOV3細胞從第4天開始增殖能力下降，明顯低于陰性對照組細胞(P<0.05)。而空白組及陰性對照組差異無統(tǒng)計學意義，證實miRNA-29b表達能夠抑制SKOV3細胞增殖。

圖2 各組細胞中miRNA-29b的表達水平

圖3 各組細胞增殖能力的對比

2.3 miRNA-29b轉(zhuǎn)染對SKOV3細胞侵襲能力的影響 結(jié)果(圖4)顯示：轉(zhuǎn)染miRNA-29b顯著減少了通過聚碳酸酯膜的SKOV3細胞數(shù)量，抑制了SKOV3細胞的侵襲能力，與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而空白組及陰性對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。

2.4 miRNA-29b轉(zhuǎn)染對凋亡相關蛋白Bcl-2和侵襲相關蛋白MMP-9表達的影響 結(jié)果(圖5)顯示：轉(zhuǎn)染miRNA-29b mimic后，卵巢癌細胞SKOV3中抑制凋亡蛋白Bcl-2和侵襲相關蛋白MMP-9的表達均下調(diào)，與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；空白組及陰性對照組差異均無統(tǒng)計學意義。

圖4 各組細胞侵襲能力的對比

圖5 各組細胞中Bcl-2和MMP-9蛋白表達水平的對比

3 討 論

惡性腫瘤的發(fā)生涉及人體多種原癌基因和抑癌基因的表達失衡。與其他惡性腫瘤一樣，卵巢癌的發(fā)生發(fā)展是多因素影響下的多基因、多步驟的惡性增殖的動態(tài)過程，其中miRNA所調(diào)控的基因表達機制在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。miRNA-29是在2003年由Dostie等[5]在人神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)，其編碼序列位于人體染色體的1q32.2:207801852-207801939位點。miRNA-29家族成員主要包括miRNA-29a、miRNA-29b和miRNA-29c，其中miRNA-29b主要定位于細胞核中，能夠與多種目標靶基因的mRNA發(fā)生特異性結(jié)合，從而在調(diào)控目標基因的表達水平[5]。Wang等[6]研究證實，人乳腺癌組織中miRNA-29b的表達異常增加；以人乳腺癌細胞MDA-MB-231為模型，發(fā)現(xiàn)抑制miRNA-29b的表達后能夠促進抑癌蛋白PTEN的表達，從而抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲能力。而在人前列腺癌細胞PC3和LNCaP中，miRNA-29b的表達下降；通過慢病毒轉(zhuǎn)染增強前列腺癌細胞中miRNA-29b的表達水平，能夠顯著抑制前列腺癌細胞的侵襲能力，其作用可能與E-cadherin相關信號通路有關[7]。在原發(fā)性肝癌中，血清miRNA-29b的表達下降程度與患者的疾病進展和預后顯著相關，證實miRNA-29b在原發(fā)性肝癌中發(fā)揮抑癌作用[8]。本研究中，人卵巢癌上皮細胞系SKOV-3細胞中miRNA-29b的表達下降；與IOSE80細胞相比，轉(zhuǎn)染miRNA-29b mimic后，SKOV-3細胞中miRNA-29b的表達水平增加，SKOV3細胞增殖能力從第4天開始下降，同時SKOV3細胞的侵襲能力下降，初步證實了miRNA-29b在卵巢癌中發(fā)揮了抑癌基因的作用。

B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)是重要的細胞凋亡蛋白之一。研究認為，Bcl-2能夠顯著抑制由多種細胞毒因素(如化療)所引起的凋亡機制，同時能夠增強腫瘤細胞對DNA損傷因子的抗性，可作為原發(fā)性上皮性卵巢癌的耐藥性和預后判斷的預測因子[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miRNA-29b mimic后，卵巢癌細胞SKOV3中抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達降低，與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9, MMP-9)能夠降解細胞外基質(zhì)的鋅離子依賴型內(nèi)肽酶，與多種惡性腫瘤的侵襲性密切相關[10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9在卵巢癌組織中高表達，且其表達水平與卵巢癌患者的生存期負相關[11]。而Zou等[12]的研究顯示，MMP-9調(diào)控卵巢癌細胞的侵襲能力是與IL-6的介導作用密切相關。轉(zhuǎn)染miRNA-29b mimic后，卵巢癌細胞SKOV3中侵襲相關蛋白MMP-9的表達降低，與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-29b能夠抑制卵巢癌細胞的增殖和侵襲能力，具有作為卵巢癌早期診斷和靶向治療的分子靶點的潛在價值，其作用可能通過抑制凋亡相關蛋白Bcl-2和侵襲相關蛋白MMP-9的表達來實現(xiàn)。