向俊蓓 萬謙

摘 要：為研究耐熱基因BnTR1對不同腫瘤細胞增殖的抑制作用，構建BnTR1條件表達載體，瞬時轉染4種不同分化程度的腫瘤細胞。Western blot檢測結果顯示BnTR1的表達水平在幾種腫瘤細胞中相近；MTT檢測結果顯示HGC和AGS的細胞增殖受到抑制，抑制作用HGC > AGS，而HT-29和MCF-7的細胞增殖不受到抑制。推斷BnTR1對于分化程度低的腫瘤細胞增殖有抑制作用，而對于分化程度高的腫瘤細胞的增殖無明顯抑制。

關鍵詞：BnTR1 腫瘤啟動子 腫瘤細胞的分化程度

中圖分類號：S853.53 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2018）3（a）-0000-00

BnTR1基因（GU204975.1）來源于甘藍型油菜 [1]，在植物中的功能包括抗熱脅迫、抗鹽脅迫等[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)BnTR1對人宮頸癌細胞Hela和人肺癌細胞A549的增殖具有抑制作用，該抑制作用可以與抗癌化學藥物順鉑cisplatin對Hela細胞和A549細胞的增殖抑制作用協(xié)同[3]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，BnTR1編碼一種泛素系統(tǒng)的E3連接酶，能對多種蛋白質包括某些轉錄因子進行泛素化[1，3-5]； BnTR1發(fā)揮抗脅迫功能和抑制腫瘤細胞增殖的功能，必須有其N端蛋白質結構中的RING結構域的存在[1，5]。由于人腫瘤細胞按不同標準可以分成許多不同類型，包括按分化程度的不同，可以大致劃分為未分化、低分化和高分化，而其惡性程度的排序是：未分化>低分化>高分化。同時，不同分化程度的腫瘤細胞對于干預作用的反應是有差異的。因此，BnTR1能夠抑制人腫瘤細胞增殖的特性值得深入研究。

基于此目的，研究中構建BnTR1條件表達載體，瞬時轉染多種腫瘤細胞（人胃癌細胞HGC（未分化腫瘤細胞）、人胃癌細胞AGS（低分化腫瘤細胞）、人結腸癌細胞HT-29（高分化的腫瘤細胞）、人乳腺癌細胞MCF-7（高分化的腫瘤細胞））后，分別進行Western blot檢測和MTT檢測，分析TR1表達與腫瘤細胞的增殖表現(xiàn)的聯(lián)系。

1 實驗材料和方法

1.1 條件表達載體構建

（1）全基因合成人腫瘤基因c-ErbB-2的啟動子序列，在5末端加上限制性內(nèi)切酶AflII的酶切位點和保護堿基，同時在3末端加上限制性內(nèi)切酶BamHI的酶切位點和保護堿基。利用基因克隆技術，將合成的全基因序列整合到pcDNA 3.1（+）上的AflII和BamHI的酶切位點之間，備用；高保真PCR酶擴增BnTR1全cDNA片段，并且分別在5端和3端加上BamHI和EcoRI序列和保護堿基，同時在5端BamHI的位點后加入蛋白質片段標記Flag tag，備用；

（2）利用基因克隆技術，拼接前述備用DNA片段，構建目標載體pcDNA 3.1（+）-c-ErbB-2-Flag tag-BnTR1。擴增質粒中插入BnTR1片段；測序驗證序列正確性。

1.2 腫瘤細胞瞬時轉染

分別培養(yǎng)腫瘤細胞包括HGC（未分化）、AGS（低分化）、HT-29（高分化）、MCF-7（高分化），并進行質粒pcDNA 3.1（+）-c-ErbB-2-Flag tag-BnTR1的瞬時轉染[7]：每種處理6孔重復，質粒pcDNA 3.1（+）做為對照；

1.3 Western blot檢測

收獲轉染BnTR1的細胞和對照細胞并分別提取蛋白質混合物，Western blot[8]檢測BnTR1的表達。使用兔抗BnTR1血清（自制抗血清）和兔抗人Beta-actin的一抗（中杉金橋，中國），小鼠抗兔的帶辣根過氧化物酶（HRP）的二抗（中杉金橋，中國），ECL溶液購自碧云天公司。

1.4 MTT法檢測腫瘤細胞的增殖

瞬時轉染72小時后，使用MTT法[9]檢測腫瘤細胞的增殖情況。使用MTT原液（0.5 mg/ml）（Sigma Inc.，USA）；二甲基亞砜DMSO（Sigma Inc.，USA）；

檢測波長為570nm，參比波長為655 nm。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每種條件獲得6個OD570nm的數(shù)據(jù)，去除最高值和最低值，分析中分別對比轉染pcDNA 3.1（+）-c-ErbB-2-Flag tag-BnTR1的實驗組和轉染pcDNA 3.1（+）的對照組，使用軟件SPSS 19.0進行獨立樣本t檢驗，比較實驗組和對照組的細胞數(shù)量均值。

2 結果

2.1 載體構建與轉染

測序結果顯示BnTR1條件表達載體構建成功，Western結果顯示瞬時轉染后，BnTR1的蛋白質表達水平在HGC、AGC、HT-29和MCF-7中相近。

2.2 不同腫瘤細胞的增殖情況

HGC和AGS細胞的增殖受到BnTR1的瞬時轉染的顯著抑制（P = 0.03和P = 0.02），抑制率分別是17%和10%；而HT-29和MCF-7細胞的增殖未受到BnTR1的瞬時轉染的顯著抑制（P = 0.81和P = 0.39）。

3 討論

研究中選擇腫瘤基因c-ErbB-2的啟動子，c-ErbB-2是一種腫瘤基因，具有在腫瘤細胞中高表達的特點。結果表明不同腫瘤細胞經(jīng)過瞬時轉染后，BnTR1的表達水平相近，而不同腫瘤細胞對于瞬時轉染的反應性有差異。表達質粒對于處于未分化程度的HGC和處于低分化程度的AGS的增殖能限制抑制，而對高分化程度的HT-29和MCF-7的增殖不抑制，分化程度越低，BnTR1的抑制作用越顯著。有文獻報道BnTR1能抑制Hela和A549細胞的增殖[5]，而Hela和A549均為分化程度低的腫瘤細胞，故本研究結論為BnTR1對腫瘤細胞增殖的抑制功能與細胞分化程度的相關性提供了新的支撐數(shù)據(jù)。

參考文獻

[1] Liu ZB， Wang JM， Yang FX， Yang L， Yue YF， Xiang JB， Gao M， Xiong FJ， Lv D， Wu XJ， Liu N， Zhang X， Li XF， Yang Y. A novel membrane-bound E3 ubiquitin ligase enhances the thermal resistance in plants. Plant Biotechnol.J.，2014，12（1）：93-104.

[2] 陳彩麗，曹昊昊，樊莉娟，等.過量表達BnTR1油菜對多種逆境的抗性分析.四川大學學報（自然科學版），2017，54（1）：215-220.

[3] Qian Wan， Zhibin Liu， Wenzhen Peng， Jianmei Wang， Xufeng Li， Yi Yang. BnRCH gene inhibits cell growth of Hela cells through increasing the G2 phase of cell cycle.Human Cell，2011，240：150-160.