朱俊杰，徐靜

（海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南?？?70228）

大青（Clerodendrum cyrtophyllum Turcz）為馬鞭草科（Verbenaceae）大青屬（Clerodendrum）植物，分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在江西、湖南、湖北、廣州、海南等地普遍生長，與十字花科菘藍(lán)屬大青有別。大青為落葉灌木，又稱為羊咩青、路邊青、臭大青等。據(jù)文獻(xiàn)記載[1]，大青全株均具有藥用功效，其作用包括緩解牙齦腫痛、解毒利尿、消炎止血等。大青中主要含有黃酮類、萜類、甾醇類及糖苷類化合物，主要活性成分包括山大青苷、類葉升麻苷、連翹苷、沒食子酸、鞣質(zhì)等[2-6]。近年來關(guān)于大青的藥理研究主要包括抗炎[7]、抗菌[7-8]、鎮(zhèn)痛[9]、降壓[10]等方面。Zhou 等在先前的研究中[11]，以總黃酮和總酚含量，清除 DPPH·、ABTS+·、·OH 能力，螯合金屬離子能力以及還原能力共7個指標(biāo)，對大青葉的超聲輔助乙醇提取的條件進(jìn)行了優(yōu)化，并指出石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水相萃取物均具有相應(yīng)的抗氧化能力。

過量飲酒會引起身體內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生，從而引起脂肪肝和酒精性肝炎，進(jìn)而誘發(fā)肝纖維化、肝硬化、肝癌等一系列病癥[12]。酒精性肝病發(fā)病率正逐年攀升，已經(jīng)成為當(dāng)前威脅公眾健康的嚴(yán)重問題，但應(yīng)對此種病癥的治療手段卻捉襟見肘。因此，對酒精性肝病的預(yù)防顯得格外重要。目前，奶薊草由于具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、增加肝細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的功效[13]，朝鮮薊由于對CCl4引起的肝損傷具有保護(hù)作用[14]，黃芩、半枝蓮和刺五加等植物中具有的黃酮類成分對肝臟具有保護(hù)作用[15]，均被制成不同形式的護(hù)肝功能性食品，諸如護(hù)肝片、護(hù)肝膠囊等，作為預(yù)防和輔助治療肝病的食品補充劑。

HepG2細(xì)胞具有正常肝細(xì)胞的生理功能，又具有癌細(xì)胞增殖速度快的特點，因此被廣泛應(yīng)用于肝細(xì)胞毒性、肝脂質(zhì)代謝和體外代謝研究，是從細(xì)胞層面研究肝細(xì)胞損傷的良好模型。本文利用酒精誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷建立酒精性肝損傷模型，采用大青葉醇提物以及石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物預(yù)處理的方式，研究它們對HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用，為大青葉在功能性保健食品中的應(yīng)用提供基本依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌HepG2細(xì)胞株：中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

大青葉于3月份采自海南省?？谑谢鹕饺旱刭|(zhì)公園，經(jīng)海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院楊小波教授鑒定為馬鞭草科植物大青（Clerodendrum cyrtophyllum Turcz）的葉。

MEM 細(xì)胞培養(yǎng)基（minimum Eagle’s medium）：北京中科邁晨科技有限公司；胎牛血清：浙江天杭生物科技股份有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、0.25%胰蛋白酶（250 U/mg）、BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒、ECL試劑盒：武漢博士德生物科技有限公司；噻唑藍(lán) [3-（4，5-Dimethyl-2-Thiazolyl）-2，5-Diphenyl Tetrazolium Bromide，MTT]：美國 Sigma 公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）測試盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、微量還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）測試盒、細(xì)胞丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒：南京建成生物工程研究所；無水乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亞砜（均為分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；6/96孔細(xì)胞培養(yǎng)板：美國Corning公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Galaxy R CO2培養(yǎng)箱：英國RS Biotech公司；Infinite M2000 Pro多功能酶標(biāo)儀：瑞典Tecan公司；SWCJ-2FD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；5415R高速冷凍離心機(jī)：德國eppendorf公司；VCX細(xì)胞破碎儀：美國SONICS公司；HC-500T2高速多功能粉碎機(jī)：永康市天棋盛世工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大青葉提取物的制備

大青葉乙醇提取物的制備依照Zhou等[11]的方法。取部分乙醇提取物浸膏，在50℃水浴條件下，用1 000 mL蒸餾水將其溶解，然后順次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別等體積萃取3次、反萃取1次。萃取所得的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水五相萃取液經(jīng)旋蒸濃縮后，與剩余乙醇提取物浸膏一起，經(jīng)冷凍干燥處理得固體粉末，密封后置于零下20℃存放備用。

1.3.2 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞生長于含有10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。細(xì)胞長滿80%左右后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.3 酒精誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷模型的建立

參照曹佩琴等[16]的方法并略作修改。將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以1×105個/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h。更換含有不同濃度（0～0.7 mol/L）酒精的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔。棄上清液，分別加入 100 μL 含 MTT（1 mg/mL）的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，棄上清液，每孔加入200 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），用旋渦振蕩器低速振蕩10 min溶解，并設(shè)置溶劑空白孔（只含有200 μL DMSO），使用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測吸光度（A），利用以下公式計算細(xì)胞存活率。

1.3.4 大青葉提取物對HepG2細(xì)胞毒性的檢測

參照曹佩琴等[16]的方法并略作修改。細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h后，更換含有不同濃度（1 μg/mL～10 μg/mL）大青葉醇提物或石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物的培養(yǎng)液處理繼續(xù)培養(yǎng)24h，每組設(shè)6個復(fù)孔。棄上清液，用PBS清洗3次。MTT檢測方法同1.3.3，并計算細(xì)胞存活率。

1.3.5 大青葉提取物抵抗酒精毒性的細(xì)胞存活率檢測

參照曹佩琴等[16]的方法并略作修改。細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h后，對照組、酒精組更換培養(yǎng)液，提取物各組更換含有不同濃度（1 μg/mL～10 μg/mL）大青葉醇提物或石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物的培養(yǎng)液預(yù)處理細(xì)胞24 h，每組設(shè)6個復(fù)孔。隨后對照組更換培養(yǎng)液，酒精組和提取物組用含酒精濃度為0.4 mol/L的培養(yǎng)液孵育24 h。MTT檢測方法同1.3.3節(jié)，并計算細(xì)胞存活率。

1.3.6 細(xì)胞內(nèi)ROS含量的測定

ROS含量的檢測方法參照試劑盒說明書。細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h，按照1.3.5節(jié)經(jīng)大青葉提取物及酒精處理后，加入DCFH-DA濃度為10 μmol/L的培養(yǎng)液孵育30 min，用PBS洗滌細(xì)胞2次，在激發(fā)波長500 nm、發(fā)射波長525 nm條件下用熒光酶標(biāo)儀檢測熒光強度，利用以下公式計算ROS相對含量。每組均設(shè)6個復(fù)孔。

ROS相對含量/%=（試驗組熒光強度）/（對照組熒光強度）×100

1.3.7 細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH、SOD的測定

細(xì)胞以2×106個/mL的密度接種于6孔板培養(yǎng)24 h，按照1.3.5經(jīng)大青葉提取物及酒精處理。依照試劑盒操作說明，使用硫代巴比妥酸法檢測MDA含量，二硫代二硝基苯甲酸法檢測GSH含量，水溶性四唑鹽法檢測SOD活力，各組中均設(shè)6個復(fù)孔。使用細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，并用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白含量。

1.3.8 統(tǒng)計學(xué)分析

試驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=6。使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行One-Way ANOVA分析，p＜0.05為具有顯著性差異，Origin 9.0軟件作圖。。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒精對HepG2細(xì)胞損傷模型的建立

利用MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，如圖1所示，使用濃度為0～0.7 mol/L的酒精誘導(dǎo)損傷24 h后，HepG2細(xì)胞的存活率逐漸下降，呈濃度依賴性。在0.1mol/L～0.7 mol/L酒精濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞的存活率便與不含酒精的對照組具有顯著差異（p＜0.05）。在酒精濃度達(dá)到0.4 mol/L時，細(xì)胞存活率降低至50%左右。因此，將誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷模型的酒精濃度設(shè)置為0.4 mol/L。

2.2 大青葉提取物對HepG2細(xì)胞的毒性作用

MTT法檢測大青葉醇提物和五相萃取物分別在1、5、10 μg/mL 3 個濃度下孵育 HepG2 細(xì)胞 24 h 后存活率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖1 不同濃度的酒精對HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Cell viability of HepG2 cells following different concentrations of alcohol exposure

圖2 大青葉提取物對HepG2細(xì)胞毒性的影響Fig.2 Cytotoxicity of C.cyrtophyllum Turcz leaves extracts to HepG2 cells

隨著劑量的增加，試驗組的細(xì)胞存活率稍有下降，但均保持在90%以上。且與對照組相比，試驗組的細(xì)胞存活率均無明顯差異，即未表現(xiàn)出明顯毒性作用，因此可在1、5、10 μg/mL濃度下進(jìn)行細(xì)胞保護(hù)處理。

2.3 大青葉提取物對酒精誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷的影響

大青葉提取物對細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用見圖3。

由圖3可知，與對照組相比，酒精組的細(xì)胞經(jīng)過酒精損傷后存活率降低約50%，差異顯著（p＜0.01）。與酒精組相比，醇提物預(yù)處理后的細(xì)胞存活率隨著濃度的增加而明顯提升（p＜0.01），成濃度依賴性，說明其HepG2細(xì)胞的酒精性損傷具有保護(hù)作用；石油醚相和二氯甲烷相萃取物預(yù)處理后的細(xì)胞存活率隨著濃度的增加而稍有提升，但無顯著差異（p＞0.05），說明其無明顯保護(hù)作用；乙酸乙酯相、正丁醇相和水相萃取物預(yù)處理后的細(xì)胞存活率隨著濃度的增加而顯著提升（p＜0.01），在 10 μg/mL 濃度下，乙酸乙酯相的提升最明顯，水相、正丁醇相次之，且乙酸乙酯相和水相的存活率均高于醇提物的。

圖3 大青葉提取物對細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用Fig.3 Effect of C.cyrtophyllum Turcz leaves extracts on HepG2 cells viability in response to alcohol

2.4 大青葉提取物對ROS含量的影響

大青葉提取物預(yù)處理對HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響見圖4。

圖4 大青葉提取物預(yù)處理對HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響Fig.4 Effect of C.cyrtophyllum Turcz leaves extracts on the level of ROS in HepG2 cells induced by alcohol

如圖4所示，經(jīng)濃度為0.4 mol/L的酒精處理24 h后，HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的生成量較對照組明顯上升（p＜0.01）。而在使用10 μg/mL濃度的醇提物和二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物預(yù)處理后，與酒精組相比，ROS的生成量明顯降低（p＜0.05），石油醚相的沒有明顯變化。并且，乙酸乙酯相的ROS水平要低于醇提物的。

2.5 大青葉提取物對細(xì)胞內(nèi)MDA含量的影響

大青葉提取物預(yù)處理對HepG2細(xì)胞內(nèi)MDA的影響見圖5。

圖5 大青葉提取物預(yù)處理對HepG2細(xì)胞內(nèi)MDA的影響Fig.5 Effect of C.cyrtophyllum Turcz leaves extracts on the level of MDA in HepG2 cells induced by alcohol

如圖5所示，與對照組相比，酒精組細(xì)胞內(nèi)MDA生成量明顯升高（p＜0.01），說明0.4 mol/L酒精能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的脂質(zhì)過氧化。但在給予10 μg/mL濃度的醇提物和乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物預(yù)處理后，與酒精組相比，MDA的生成量明顯降低（p＜0.05），石油醚相及二氯甲烷相的沒有明顯變化。乙酸乙酯相保護(hù)細(xì)胞免受脂質(zhì)過氧化的能力要高于醇提物，正丁醇相和水相的能力與醇提物相當(dāng)。

2.6 大青葉提取物對細(xì)胞內(nèi)GSH含量的影響

大青葉提取物預(yù)處理對HepG2細(xì)胞GSH的影響見圖6。

圖6 大青葉提取物預(yù)處理對HepG2細(xì)胞GSH的影響Fig.6 Effect of C.cyrtophyllum Turcz leaves extracts on the levels of GSH in HepG2 cells induced by alcohol

如圖6所示，酒精處理24 h能使HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH含量驟然降低，說明細(xì)胞為抵御就近的刺激消耗了大量GSH。在經(jīng)過醇提物和乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物預(yù)處理的細(xì)胞內(nèi)，與酒精組相比，GSH的損失量明顯減少，尤其是乙酸乙酯相的最為明顯（p＜0.01），醇提物、水相、正丁醇相次之，石油醚相、二氯甲烷相無顯著效果（p＞0.05）。

2.7 大青葉提取物對細(xì)胞內(nèi)SOD活力的影響

大青葉提取物預(yù)處理對HepG2細(xì)胞SOD的影響見圖7。

圖7 大青葉提取物預(yù)處理對HepG2細(xì)胞SOD的影響Fig.7 Effect of C.cyrtophyllum Turcz leaves extracts on the levels of SOD in HepG2 cells induced by alcohol

如圖7所示，與對照組相比，酒精組細(xì)胞內(nèi)SOD活力明顯下降（p＜0.01），表示0.4 mol/L的酒精可以導(dǎo)致HepG2細(xì)胞抗氧化能力下降。與酒精組相比，醇提物預(yù)處理可以使細(xì)胞內(nèi)SOD活力明顯提升（p＜0.05）；萃取物中，乙酸乙酯相預(yù)處理所提升的SOD活力最強，水相、正丁醇相次之；石油醚相和二氯甲烷相無明顯改善效果（p＞0.05）。

3 討論與結(jié)論

過量飲用含酒精的飲料時，酒精作為氧化劑會對身體造成一定的傷害。在酒精的代謝過程中累積產(chǎn)生的ROS會抑制谷胱甘肽的合成，從而破壞人體內(nèi)的抗氧化機(jī)制，同時會引起細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生成對機(jī)體具有損傷作用的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA[17]。MDA因此作為生物體脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物。研究通過MTT法首先檢測不同濃度酒精誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷的程度，發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞的存活率隨著酒精濃度的增加而降低，呈濃度依賴性，并且濃度為0.4 mol/L時存活率減半。然而，使用不同質(zhì)量濃度的大青葉醇提物預(yù)先處理24 h后，HepG2細(xì)胞的存活率較未預(yù)先處理的酒精損傷細(xì)胞明顯提升（p＜0.01），乙酸乙酯相、正丁醇相和水相萃取物具有同樣作用效果，乙酸乙酯相所提升的細(xì)胞存活率尤為明顯，高于醇提物，石油醚相和二氯甲烷相萃取物無明顯作用效果。同時發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞暴露于酒精（0.4 mol/L）24 h后，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平明顯升高（p＜0.01），而預(yù)先用大青葉醇提物和乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物處理HepG2細(xì)胞后，ROS的生成得到明顯的抑制（p＜0.01），抑制能力乙酸乙酯相＞水相＞醇提物＞正丁醇相，石油醚相和二氯甲烷相無明顯抑制作用。酒精刺激后的HepG2細(xì)胞內(nèi)MDA含量增加近一倍，預(yù)先用大青葉醇提物和乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物處理可以降低其生成量，乙酸乙酯相的作用效果最為明顯，石油醚相和二氯甲烷相無明顯效果。大青葉提取物之所以表現(xiàn)出抑制細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA的生成的能力，可能是由于其含有較多的酚類、黃酮類以及苯乙醇苷類等具有較強抗氧化活性的化合物[18]。已有相關(guān)文獻(xiàn)指出[16，19]，植物中的抗氧化劑能夠減少肝細(xì)胞中ROS的生成，從而減少由其引發(fā)的細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，防止氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。

酒精在機(jī)體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生的中間體乙醛是一種高活性分子，同樣能引起細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化，可能與脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物一起導(dǎo)致肝細(xì)胞以及其他組織的損傷[20]。更為重要的是，乙醛與巰基具有高親和力，這種特性使它能與抗氧化酶上的巰基結(jié)合形成席夫堿，從而削弱人體內(nèi)抗氧化酶的抗氧化能力，這些抗氧化酶包括SOD、CAT、GSH-Px等[21]。SOD是細(xì)胞內(nèi)抵抗氧化應(yīng)激的只要抗氧化酶，它能將氧化應(yīng)激產(chǎn)生的處于活躍狀態(tài)的超氧化物轉(zhuǎn)化為毒害較弱的過氧化氫，再通過CAT和GPx將其分解成水和氧[22]。GSH是細(xì)胞內(nèi)抵抗ROS的主要抗氧化分子之一。GSH在GST的催化作用下能與細(xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)結(jié)合，再經(jīng)由細(xì)胞膜被排出[23]。本試驗中，酒精的誘導(dǎo)能顯著降低HepG2細(xì)胞內(nèi)SOD活力和GSH含量，指示細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)已經(jīng)失衡，使其遭受了嚴(yán)重氧化損傷。但在大青葉醇提物和乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物預(yù)處理后，損傷細(xì)胞內(nèi)的SOD活力、GSH含量得到不同程度的提升，指示它們能夠抵御酒精造成的氧化損傷，幫助HepG2細(xì)胞恢復(fù)抗氧化機(jī)制，增強抗氧化能力。石油醚相和二氯甲烷相無明顯改善作用。

大青葉醇提物對酒精性肝損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制依賴于所具有的抗氧化活性。乙酸乙酯相、正丁醇相和水相萃取物是大青葉醇提物的有效部位，其中乙酸乙酯相萃取物的肝細(xì)胞保護(hù)作用最強，可以作為今后重點研究對象。本試驗為大青葉作為具有抗氧化能力、護(hù)肝作用的保健食品提供了一定的理論研究依據(jù)。