卜冬云 吳中飛 陸美萍 錢俊俊 程雷,2,3

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是一種鼻黏膜慢性炎癥性疾病，不僅具有典型的鼻部癥狀，如鼻癢、鼻塞、噴嚏及清水樣涕，同時(shí)常伴隨諸多合并癥，如哮喘、濕疹、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性結(jié)膜炎、睡眠呼吸障礙等[1-3]，成為全球性健康問(wèn)題，中國(guó)人群患病率亦呈明顯上升趨勢(shì)[4]，不僅影響患者的生活和工作，也給家庭及社會(huì)帶來(lái)巨大的疾病負(fù)擔(dān)[5，6]。AR發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，目前認(rèn)為遺傳和環(huán)境因素在疾病發(fā)生發(fā)展中起共同調(diào)節(jié)作用[7-9]。其中，多基因遺傳因素占據(jù)著重要地位[10-14]。近來(lái)一項(xiàng)基于歐美哮喘兒童的全基因組研究和功能分析顯示，腺苷酸環(huán)化酶 2（adenylate cyclase 2，ADCY2）基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）與空氣污染存在交互作用[15]。AR與哮喘被認(rèn)為“同一氣道，同一疾病”，二者具有相似的遺傳背景和免疫學(xué)機(jī)制，為此本研究旨在探討ADCY2基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群持續(xù)性變應(yīng)性鼻炎（persistent allergic rhinitis，PER）的遺傳關(guān)聯(lián)性。

資料與方法

1 研究對(duì)象

本研究采用病例-對(duì)照的方法，病例組為2008年5月～2017年12月就診于南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科的蘇皖地區(qū)漢族人群，根據(jù)“變應(yīng)性鼻炎及其對(duì)哮喘的影響2008年更新版”（ARIA 2008 update）[16]診斷為屋塵螨和/或粉塵螨致敏的PER患者571例，其中男性353例，女性218例；年齡 3～69 歲，中位數(shù)及四分位數(shù)（M[P25，P75]，以下同）為21[13，35]歲。對(duì)照組來(lái)自蘇皖地區(qū)的健康體檢人群，均為漢族，共677例，其中男性395例，女性282例；年齡2～64歲，中位數(shù)及四分位數(shù)為26[15，33]歲。健康對(duì)照人群的納入標(biāo)準(zhǔn)為：①排除AR、哮喘、濕疹及特應(yīng)性皮炎等變態(tài)反應(yīng)疾病，且無(wú)上述疾病既往史；②排除AR、哮喘、濕疹及特應(yīng)性皮炎等變態(tài)反應(yīng)疾病的家族史；③血清特異性IgE檢測(cè)陰性（Phadiatop＜0.35 kUA/L）。本課題研究方案經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)，所有受試者均在?？漆t(yī)師指導(dǎo)下填寫(xiě)調(diào)查問(wèn)卷表，并簽署知情同意書(shū)，受試者總體參與率≥95%。

2 研究方法

2.1 樣本采集

每位受試者均抽取靜脈血2ml，室溫條件下離心，轉(zhuǎn)速3500rpm×10/min，分離出血清，采用Immuno CAP100過(guò)敏原檢測(cè)系統(tǒng)（Phadia，瑞典）進(jìn)行血清總IgE和特異性IgE測(cè)定。同時(shí)抽取5ml外周靜脈血于EDTA抗凝管，室溫下離心，轉(zhuǎn)速3500rpm×10/min，置于-70°C 冰箱，凍存，待提取 DNA。

2.2 基因組DNA提取

酚抽提法提取全血基因組DNA，母液濃度≥100ng/μL，純度為 1.8～2.0，并使用 1%瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢。最終將DNA母液稀釋至10ng/μL，作為使用液，共100μL，制備工作液置96孔板。

2.3 SNP位點(diǎn)選擇

將ADCY2基因包含其上游2kb和下游1kb序列納入分析，利用基因變異服務(wù)器（Genome Variation Server， 簡(jiǎn) 稱 GVS；http://gvs.gs.washington.edu/GVS147/）篩選出中國(guó)漢族人群（Han Chinese in Beijing，CHB）的少見(jiàn)等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）≥5%的標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性（tagSNP）。運(yùn)用美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院網(wǎng)站（http://snpinfo.niehs.nih.gov/）和RegulomeDB對(duì)每個(gè)tagSNP代表的子集中所有SNPs進(jìn)行生物信息學(xué)功能預(yù)測(cè)分析，盡可能選擇預(yù)測(cè)有功能的位點(diǎn)如外顯子、啟動(dòng)子起始位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（TF bindings sites）等，然后把預(yù)測(cè)有功能、較為重要的SNPs選入。采用SHEsis軟件（http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php）對(duì)ADCY2基因位點(diǎn)連鎖不平衡強(qiáng)度進(jìn)行分析。最終選取ADCY2基因內(nèi)含子區(qū)5個(gè)SNPs位點(diǎn)：rs1864071、rs1027579、rs2892609、rs1460970和rs326149，具體生物學(xué)信息見(jiàn)表1。

2.4 引物和探針設(shè)計(jì)

引物和探針由南京驥驁生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成（表2），并以粉末狀包裝運(yùn)送，實(shí)驗(yàn)前將引物和探針離心后稀釋至使用濃度，冷凍避光保存，備用。

表1 ADCY2基因選擇的SNPs位點(diǎn)及生物信息學(xué)分析

a引物及探針堿基排列方向均按照5’至3’端

2.5 基因分型

配置PCR的反應(yīng)體系（5μL）：1μL DNA模板，2.5μL TaqManRUniversal PCR Master Mix，上下游引物各0.25μL，探針1和探針2各0.125μL，去離子水1.25μL。體系置于 ABI7900（Applied Biosystems，美國(guó)）進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)條件：預(yù)反應(yīng)50℃（2min），95℃（10min）；PCR 擴(kuò)增 95℃（15sec），60℃（1min），45個(gè)循環(huán)。ABI7900分析軟件SDS 2.4讀取結(jié)果，數(shù)據(jù)導(dǎo)出后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

人群流行病學(xué)資料采用EpiData 3.0軟件（EpiData Association，丹麥）進(jìn)行錄入和管理。各研究變量分布差異的比較采用獨(dú)立樣本Student’s-t檢驗(yàn)（用于連續(xù)性變量）或雙側(cè)χ2檢驗(yàn)（用于分類變量）。對(duì)照組中各SNPs位點(diǎn)的Hardy-Weinberg平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE） 檢 驗(yàn) 采 用Pearson χ2擬合優(yōu)度檢驗(yàn)。采用二分類Logistic回歸得到的粗比值比（odds ratio，OR）、校正OR及95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）用以評(píng)估ADCY2多態(tài)性與塵螨致敏PER的相關(guān)性。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 一般資料

各研究變量在病例組與對(duì)照組中的分布見(jiàn)表3，兩組的年齡、性別分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。全體研究對(duì)象的年齡中位數(shù)及四分位數(shù)為25[14，34]歲。病例組血清總 IgE（192[74.8，404]kUA/L）明顯高于對(duì)照組（31.3[13.94，61.69]kUA/L），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；病例組屋塵螨和粉塵螨特異性 IgE 分別為（11.8[0.62，52.04]）kUA/L和（8.07[0.61，37.95]）kUA/L。在病例組中，118 例（20.7%）合并哮喘，163例（28.5%）合并特應(yīng)性皮炎。

2 關(guān)聯(lián)分析

ADCY2基因的5個(gè)SNPs均符合HWE（P＞0.05）。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果（表4）顯示：rs1864071基因型頻數(shù)在病例組和對(duì)照組中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在相加模型中，該位點(diǎn)在病例組和對(duì)照組中CC基因攜帶者較TT基因攜帶者發(fā)生PER的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加（校正 OR=1.226，95%CI=1.045-1.439；P=0.013）；在顯性模型中，TC+CC基因攜帶者相比TT基因攜帶者發(fā)生PER的風(fēng)險(xiǎn)也明顯增加（校正OR=1.343,95%CI=1.039-1.736；P=0.024）。其余 SNPs位點(diǎn)在各組中基因型和等位基因型頻數(shù)分布的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 研究對(duì)象的一般資料

表4 ADCY2基因多態(tài)性與塵螨致敏的持續(xù)性變應(yīng)性鼻炎的關(guān)聯(lián)分析

討論

變態(tài)反應(yīng)疾病的發(fā)生受到遺傳-環(huán)境的共同影響，二者都發(fā)揮著重要作用。隨著流行病學(xué)研究的大量開(kāi)展，多基因遺傳因素已不足以解釋其患病率的顯著增加，空氣污染所導(dǎo)致的表觀遺傳學(xué)變化在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越受到關(guān)注，且空氣污染與外周血細(xì)胞DNA甲基化相關(guān)已得到證實(shí)[17]。同時(shí)有研究表明，SNPs與DNA甲基化密切相關(guān)。一方面，人類基因組甲基化的CpG位點(diǎn)本身具有較高的突變頻率，且當(dāng)突變超越機(jī)體修復(fù)能力時(shí)，便形成新的SNPs位點(diǎn)[18]；另一方面，SNPs可影響啟動(dòng)子活性，從而形成新的DNA甲基化位點(diǎn)[19]。

ADCY2為腺苷酸環(huán)化酶家族成員，是一種膜相關(guān)蛋白，主要分布在人體腦組織、骨骼肌、睪丸中，也分布在肝臟、腎臟及腸道中[20]，能夠催化第二信使環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的形成，并參與G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPR）信號(hào)通路[21]。已知 GPR154 基因多態(tài)性與哮喘、氣道高反應(yīng)性及血清總IgE有明顯關(guān)聯(lián)[22，23]。屋塵螨的主要變應(yīng)原Der p1可活化肥大細(xì)胞相關(guān)GPR，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子IL-6的釋放，這對(duì)于變應(yīng)性哮喘和AR通過(guò)神經(jīng)源性炎癥機(jī)制發(fā)病可能有臨床相關(guān)性[24]。近來(lái)有研究顯示，ADCY2基因的差異表達(dá)與空氣污染暴露水平有關(guān)，且其甲基化水平降低與空氣污染短期暴露有關(guān)，兒童哮喘的發(fā)病與空氣污染及ADCY2等基因存在交互作用[15]。全基因組關(guān)聯(lián)研究還表明，ADCY2基因SNPs與慢性阻塞性肺疾?。–OPD）及肺功能有關(guān)[25，26]。而COPD能夠增加AR等非感染性鼻炎的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，提示上下氣道炎癥的相關(guān)性[27]。

大量流行病學(xué)[16，28]、病理生理學(xué)[29，30]及臨床證據(jù)[31，32]表明，AR 與哮喘是一種“整體氣道疾病”[3]。本次研究發(fā)現(xiàn)，ADCY2基因內(nèi)含子區(qū)的rs1864071位點(diǎn)與蘇皖漢族人群中塵螨致敏的PER顯著相關(guān)。關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，rs1864071位點(diǎn)在病例組和對(duì)照組中的相加模型（CC/TT）及顯性模型（TC+CC/TT）發(fā)生PER的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高。而已有的報(bào)道表明，在所研究的歐美哮喘兒童中，ADCY基因3個(gè)SNPs與空氣污染存在交互作用，但本次研究未在我們的人群中進(jìn)行這些SNPs位點(diǎn)與PER的關(guān)聯(lián)分析，因此，ADCY2基因不同SNPs位點(diǎn)與不同人群中PER的相關(guān)性值得進(jìn)一步探討。

綜上所述，在蘇皖漢族人群中，ADCY2基因rs1864071位點(diǎn)與PER顯著關(guān)聯(lián)，該基因可能影響塵螨致敏PER的遺傳易感性。當(dāng)然，本研究還存在某些不足，例如沒(méi)有探討基因與環(huán)境因素的交互作用，也未進(jìn)行基因功能分析。同時(shí)我們的研究人群包含兒童及成人（2～69歲），而文獻(xiàn)報(bào)道的研究人群為學(xué)齡兒童（7.4～11.3歲），故ADCY2基因多態(tài)性與變態(tài)反應(yīng)疾病發(fā)病年齡的相關(guān)性也有待進(jìn)一步驗(yàn)證。