張曉瑞，張福生，廖登群，孫 鵬，祁建軍，李先恩#

(1山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,太原 030006;2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所;*通訊作者,E-mail:ample1007@sxu.edu.cn;#共同通訊作者,E-mail:xeli@implad.ac.cn)

重樓是多年生百合科草本藥用植物。在《中國(guó)藥典》收錄的重樓品種有七葉一枝花ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara和云南重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz兩種,主要用于疔瘡癰腫,咽喉腫痛,蛇蟲(chóng)咬傷等疾病的治療[1]。隨著中醫(yī)藥在國(guó)內(nèi)外的影響力不斷提高,重樓的藥用價(jià)值日益受到人們的重視,作為主要原料藥材在云南白藥、宮血寧、季德勝蛇藥等的廣泛應(yīng)用。由于我國(guó)適宜重樓生長(zhǎng)的地域環(huán)境較多,不同重樓品種分布的地區(qū)和適應(yīng)的生長(zhǎng)環(huán)境也不同[2]。

從遺傳、化學(xué)成分含量、生態(tài)因子等方面對(duì)蒙古黃芪等藥用植物的道地性研究表明:化學(xué)成分含量和生長(zhǎng)環(huán)境因素與ITS2(Internal Transcribed Spacer)序列的遺傳距離相關(guān)[3]。有研究表明不同地區(qū)生長(zhǎng)的重樓其化學(xué)成分含量差異較大[4,5]。但不同地區(qū)重樓遺傳特征的相關(guān)研究卻未曾報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)采集不同產(chǎn)地的七葉一枝花和云南重樓,并利用ITS2條形碼技術(shù)對(duì)植物遺傳序列快速、穩(wěn)定的鑒別優(yōu)勢(shì)[6],進(jìn)行樣本間序列遺傳變異特征的分析,從而進(jìn)一步在分子水平揭示重樓不同生長(zhǎng)地區(qū)發(fā)生遺傳變異的特點(diǎn),為重樓的栽培選育提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 儀器與試劑

電子天平(AL204,梅特勒-托利多);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(3K15型,德國(guó)Sigma公司);電泳儀(DYY-7C型,北京市六一儀器廠(chǎng));基因擴(kuò)增PCR儀(TC-512,英國(guó)TECHNE公司);超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(NanoDrop 2000,美國(guó)Thermo Fisher公司);冷凍研磨機(jī)(SPEX 6870 Freezer/Mill,SPEX SamplePrep公司);凝膠成像分析系統(tǒng)(JY04S-3C,北京君意)。Plant Genomic DNA Kit試劑盒(離心柱型,天根生化科技有限公司);Taq DNA Polymerase(北京欣華綠源科技有限公司);ITS2擴(kuò)增引物由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所的農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室合成;滅菌ddH2O,其他試劑均為分析純。

1.2 樣本

樣本共17份,分別為七葉一枝花Parispolyphyllavar.chinensis和云南重樓Parispolyphyllavar.yunnanensis,采集地點(diǎn)為云南、湖北、福建、四川4個(gè)省,由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院高慧敏研究員、福建省農(nóng)科院蘇海蘭鑒定。樣本存放在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所科研樓,信息見(jiàn)表1。

表1重樓實(shí)驗(yàn)17份樣本信息

Table1Informationof17experimentalsamplesofRhizomaParidis

序號(hào)編號(hào)樣本來(lái)源鑒定結(jié)果1Y1云南省西雙版納傣族自治州勐?？h云南重樓 2Y2云南省大理白族自治州云南重樓 3Y3云南省大理白族自治州彌渡縣云南重樓 4Y4云南省大理白族自治州彌渡縣云南重樓 5H1湖北省宜昌市五峰土家族自治縣七葉一枝花6H2湖北省隨州市曾都區(qū)七葉一枝花7F1福建省三明市大田縣七葉一枝花8F2福建省南平市光澤縣七葉一枝花9F4福建省南平市光澤縣七葉一枝花10F6福建省南平市光澤縣七葉一枝花11F5福建省三明市寧化縣云南重樓 12F3福建省寧化縣牙梳山保護(hù)區(qū)七葉一枝花13S1四川省雅安市石棉縣云南重樓 14S2四川省樂(lè)山市七葉一枝花15S3四川省樂(lè)山市七葉一枝花16S4四川省樂(lè)山市峨眉山市七葉一枝花17S5四川省樂(lè)山市峨眉山市七葉一枝花

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取 取適量樣品,用75%消毒酒精將樣品表面擦拭干凈,自然晾干,冷凍研磨機(jī)加入液氮充分研磨,每份樣品取80-100 mg。用Plant Genomic DNA Kit試劑盒進(jìn)行DNA提取,提取DNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序 PCR擴(kuò)增引物(上游:5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′,下游:5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′)。PCR反應(yīng)體系為25 μl,包含Taq DNA Polymerase混合液9 μl,上下游引物各1 μl(2.5 μmol/L),樣品DNA 1 μl, ddH2O 13 μl。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃變性5 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,共40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),經(jīng)純化后送至中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所測(cè)基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)驗(yàn)證,在隱馬爾可夫模型的HMMer方法[7]基礎(chǔ)上,完成各樣本的物種鑒定,并將相應(yīng)序列導(dǎo)入MEGA 4.0進(jìn)行多重比對(duì)及變異位點(diǎn)分析。再通過(guò)遺傳距離及系統(tǒng)聚類(lèi),采用鄰接法(neighbor joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(bootstrap=1 000),以顯示樣品間的進(jìn)化趨勢(shì)。

2 結(jié)果

2.1 ITS2序列比對(duì)結(jié)果及遺傳變異位點(diǎn)的分析

17份樣本的ITS2序列進(jìn)行Blast比對(duì),除Y1、Y2、S1、Y3、Y4、F5被鑒定為云南重樓外,其余均被鑒定為七葉一枝花。所有得到的序列經(jīng)Mega 4.0軟件處理,能夠準(zhǔn)確將云南重樓和七葉一枝花有效區(qū)分的序列位點(diǎn)共計(jì)8處;Y1和S5特有的變異位點(diǎn),分別有11處和1處。從序列長(zhǎng)度看,云南重樓各樣本除Y1序列長(zhǎng)度是457 bp,其余序列長(zhǎng)度均超過(guò)636 bp;而七葉一枝花各樣本除S5序列長(zhǎng)度是663 bp,其余序列長(zhǎng)度均為457 bp。上述結(jié)果顯示兩種重樓的不同樣本之間序列遺傳位點(diǎn)會(huì)產(chǎn)生變異,序列長(zhǎng)度也不完全相同。

2.2 兩種重樓ITS2序列遺傳距離

七葉一枝花和云南重樓ITS2遺傳距離結(jié)果見(jiàn)表2。七葉一枝花和云南重樓二者間的遺傳距離是0.025-0.048;七葉一枝花樣本之間遺傳距離是0-0.004;而云南重樓樣本之間的遺傳距離是0-0.054。

表2重樓樣本之間ITS2序列遺傳距離

Table2GeneticdistanceofITS2sequencebetweenRhizomaParidissamples

No1234567891011121314151617120.05430.0310.04540.0340.0480.00250.0330.0470.0010.00460.0330.0470.0010.0040.00070.0310.0450.0000.0020.0010.00180.0540.0000.0450.0480.0470.0470.04590.0330.0470.0010.0040.0000.0000.0010.047100.0330.0470.0010.0040.0000.0000.0010.0470.000110.0310.0450.0000.0020.0010.0010.0000.0450.0010.001120.0340.0480.0020.0020.0040.0040.0020.0480.0040.0040.002130.0270.0320.0230.0260.0250.0250.0230.0320.0250.0250.0230.026140.0270.0320.0230.0260.0250.0250.0230.0320.0250.0250.0230.0260.000150.0330.0470.0010.0040.0000.0000.0010.0470.0000.0000.0010.0040.0250.025160.0270.0320.0230.0260.0250.0250.0230.0320.0250.0250.0230.0260.0000.0000.025170.0330.0470.0010.0040.0000.0000.0010.0470.0000.0000.0010.0040.0250.0250.0000.025

2.3 兩種重樓ITS2序列系統(tǒng)聚類(lèi)分析

利用ITS2序列對(duì)17份重樓樣本進(jìn)行聚類(lèi)分析,鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),見(jiàn)圖1。所有樣本明顯分成七葉一枝花Parispolyphyllavar.chinensis和云南重樓Parispolyphyllavar.yunnanensis兩大支,與鑒定結(jié)果一致,其中七葉一枝花中S2和S3親緣關(guān)系較近,F4和F6的親緣關(guān)系較近,H2和S5的親緣關(guān)系近。云南重樓中Y2和S1,Y4和F5親緣關(guān)系較近。

2.4 相對(duì)遺傳距離區(qū)域分布

以?xún)煞N重樓聚類(lèi)結(jié)果最近的Y1和H2為對(duì)照,分別做七葉一枝花和云南重樓樣本之間遺傳距離的區(qū)域分布情況(見(jiàn)圖2),七葉一枝花各樣本中S2、S3、S4、S5和F2、F4、F6分別聚為一塊,樣本之間地理位置越接近,其相對(duì)遺傳距離差異就越小;而H1、H2、F1、F3與其他七葉一枝花的地理位置距離較遠(yuǎn),其相對(duì)遺傳距離差異就越大。云南重樓各樣本中Y1、S1和F5地理位置相距較遠(yuǎn),其中S1與F5相對(duì)遺傳距離較為接近,但與Y1的相對(duì)遺傳距離差異較大;Y2、Y3和Y4地理位置接近,其相對(duì)遺傳距離無(wú)明顯差異。

上半部分為七葉一枝花,下半部分為云南重樓圖1 鄰接法構(gòu)建ITS2序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 1 Construction of ITS2 sequence phylogenetic tree by neighbor-joining method

圖形大小與遺傳距離成正比圖2 七葉一枝花和云南重樓遺傳距離區(qū)域分布Figure 2 Genetic distance distribution of Paris polyphylla Smith var. chinensis(Franch.) Hara and Paris polyphylla Smith var. yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz

3 討論

通過(guò)重樓樣本所得ITS2序列間多重比對(duì)及遺傳距離、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析闡明了七葉一枝花和云南重樓的ITS2序列之間的親緣關(guān)系和遺傳特點(diǎn)。這一結(jié)果從物種遺傳的角度驗(yàn)證了李恒[2]在重樓屬植物研究中通過(guò)形態(tài)特征及演化趨勢(shì)形成的分類(lèi)系統(tǒng),證明了七葉一枝花和云南重樓是多葉重樓種下的兩個(gè)變種這一分類(lèi)方法的合理性。與遺傳距離相比,進(jìn)化樹(shù)結(jié)果能夠準(zhǔn)確將七葉一枝花和云南重樓有效區(qū)分,且能夠把同一變種內(nèi)的不同材料再次區(qū)分,遺傳距離能夠在一定程度上反映樣本間的親緣關(guān)系,但系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)呈現(xiàn)的結(jié)果更直觀(guān)。

樣本聚類(lèi)的結(jié)果中,云南重樓樣本Y1與其他樣本能夠明顯區(qū)分,應(yīng)屬于進(jìn)化過(guò)程中較早的一支,其他樣本更有可能是由其發(fā)展而來(lái)。七葉一枝花中各樣本聚類(lèi)結(jié)果較為接近,這應(yīng)該與重樓屬植物中ITS2序列相似程度高有關(guān)[8]。

從結(jié)論看,植物外觀(guān)形態(tài)鑒別和DNA條形碼(ITS2)技術(shù)都能夠鑒別七葉一枝花和云南重樓,但兩種方法也有顯著不同的特點(diǎn)。從植物形態(tài)進(jìn)行鑒別是最直觀(guān)快速的方法,而七葉一枝花和云南重樓在形態(tài)上非常相似,且要準(zhǔn)確鑒別也需從整個(gè)重樓屬植物的系統(tǒng)分類(lèi)中進(jìn)行判斷,區(qū)別二者需要有豐富的植物鑒別經(jīng)驗(yàn),因此具有一定的局限性。應(yīng)用ITS2鑒定時(shí)不受樣品外觀(guān)限制,即可對(duì)藥材進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定[9]的優(yōu)勢(shì),除了能夠?qū)ν暾闹参飿颖具M(jìn)行鑒定以外,還可以對(duì)無(wú)法辨識(shí)的樣品,包括市售的重樓根莖,用于生產(chǎn)繁殖的重樓種子都能夠有效鑒定,適合作為標(biāo)準(zhǔn)類(lèi)鑒定的方法廣泛應(yīng)用。

地理區(qū)域分布的相對(duì)遺傳距離顯示:同一種重樓(七葉一枝花或云南重樓)所生長(zhǎng)的地理位置越接近,其相對(duì)遺傳距離就越小,反之則差異越大。這就說(shuō)明不同環(huán)境下所生長(zhǎng)的重樓有著不同的進(jìn)化趨勢(shì),可見(jiàn)生長(zhǎng)區(qū)域(環(huán)境)是重樓遺傳變異及進(jìn)化趨勢(shì)的主要影響因素。但也存在不同地理位置生長(zhǎng)的重樓,其相對(duì)遺傳距離接近的現(xiàn)象,這可能與不同的地理位置卻有著類(lèi)似的氣候、土壤、光照、海拔等綜合環(huán)境因素有關(guān),至于哪種因素的影響程度更大,則需要結(jié)合相關(guān)的影響因素進(jìn)一步深入研究,以便為育種栽培等方面提供科學(xué)依據(jù)。