于利君,張三元,李 莉,張 燕,李風艷

(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦科,太原 030001;*通訊作者,E-mail:yulijun100@163.com)

宮頸癌是女性較常見的惡性腫瘤之一,近年來,宮頸癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢,并且發(fā)病年齡亦有所年輕化[1]。我國由于人口基數(shù)大,普查、篩查開展較為滯后,因此死亡率高于發(fā)達國家[2]。趨化因子受體CXCR4是趨化因子基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)的特異受體[3],CXCR4-SDF-1生物軸在宮頸癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮促進腫瘤細胞增殖的作用[4],AMD3100是CXCR4的特異性非肽類阻斷劑,可通過抑制CXCR4-SDF-1生物軸的作用降低細胞增殖、侵襲力,誘導(dǎo)細胞凋亡[5]。腫瘤的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮細胞在惡性轉(zhuǎn)化的過程中其原有的上皮表型(如E-cadherin等)降低、間葉組織表型(如Twist,slug等)增高的現(xiàn)象[6],與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7],據(jù)報道,CXCR4-SDF-1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用可能與EMT有關(guān)[8]。本研究采用AMD3100作用于宮頸癌Siha細胞株,觀察其生物學(xué)行為以及對EMT相關(guān)蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人來源宮頸癌Siha細胞系購自于中國科學(xué)院上海細胞庫。培養(yǎng)基:1640培養(yǎng)基,含10%胎牛血清;AMD3100(B&D,美國);兔源CXCR4, Twist, E-cadherin及GAPDH一抗(Santa-Cruz,美國);1640培養(yǎng)基(Sigma,美國);胎牛血清(Sigma,美國);Transwell孔板(Corning,美國)。

1.2 MTT實驗檢測細胞增殖能力

待細胞生長至指數(shù)增長期時計數(shù)板調(diào)整細胞濃度為1×104個/ml,接種于96孔板中,總體積200 μl。細胞貼壁后藥物干預(yù):實驗分為對照組及干預(yù)組,干預(yù)組AMD3100濃度分別為10,100,1 000 ng/ml,每組設(shè)5個復(fù)孔,培養(yǎng)板周邊加一圈PBS液以避免邊緣效應(yīng)。分別于24,48,72 h進行MTT檢測:每孔加MTT溶液(5 mg/ml)20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去液體,加150 μl DMSO,室溫輕搖10 min,酶標儀測定波長490 nm下的吸光度值(A)。計算細胞生長抑制率。實驗重復(fù)3次。

1.3 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲力

待細胞生長至指數(shù)增長期時,調(diào)整細胞濃度為1×104個/ml,總體積100 μl接種于上室,上室AMD3100終濃度分別為:0 ng/ml(對照組)、10 ng/ml、100 ng/ml、1 000 ng/ml。下室加入600 μl培養(yǎng)基,胎牛血清濃度20%。培養(yǎng)24 h后取出上室,基質(zhì)膠上層的細胞,甲醛固定,蘇木精復(fù)染細胞核,倒置顯微鏡計數(shù)著色細胞:隨機計數(shù)10個視野(100倍),取平均值。實驗重復(fù)3次。

1.4 劃痕愈合實驗檢測細胞遷徙能力

常規(guī)培養(yǎng)細胞于6孔板,當貼壁達到95%以上時,用中號移液器吸頭在培養(yǎng)板底部進行劃痕,PBS液洗去漂浮的細胞,加入含有不同濃度AMD3100的培養(yǎng)基。分別于劃痕后0,24,36 h觀察劃痕變化并拍照,采用Image Pro Plus軟件檢測劃痕面積。計算劃痕愈合率,計算公式:愈合率=(1-測定時面積/開始時面積)×100%。實驗重復(fù)3次。

1.5 Western blot實驗檢測蛋白的表達

收集不同濃度AMD3100干預(yù)的Siha細胞,加入細胞裂解液提取細胞總蛋白。BCA試劑盒檢測蛋白濃度,按試劑盒說明步驟操作。SDS-PAGE凝膠電泳,濕轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜。滴加一抗(CXCR4、Twist濃度1 ∶500,E-cad及GAPDH濃度1 ∶800)及二抗(濃度1 ∶3 000)。ECL發(fā)光液反應(yīng),凝膠成像儀曝光顯色,Bandscan軟件分析灰度值。CXCR4、Twist及E-cad的濃度以灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS18.0軟件分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,多組資料的比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AMD3100對Siha細胞的生長抑制作用

MTT實驗吸光度值結(jié)果顯示,培養(yǎng)24 h AMD3100濃度為100 ng/ml組及1 000 ng/ml組與對照組(0 ng/ml)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表1)。AMD3100濃度100 ng/ml 48 h及1 000 ng/ml 24 h細胞生長抑制率>50%。

表1不同濃度AMD3100培養(yǎng)不同時間的吸光度(A)

Table1Absorbanceat24h,48hand72hafterculturedwithdifferentconcentrationsofAMD3100

組別24 h48 h72 h0 ng/ml0.625±0.0920.869±0.1200.976±0.23510 ng/ml0.587±0.0940.725±0.2060.748±0.227100 ng/ml0.383±0.072*0.412±0.068*0.397±0.183*1000 ng/ml0.275±0.043*0.339±0.096*0.277±0.062*

與同一時間點0 ng/ml(對照組)相比,*P<0.05

2.2 AMD3100對Siha細胞侵襲能力的影響

AMD3100對Siha細胞侵襲能力影響的Transwell實驗結(jié)果見圖1。對照組及AMD3100 10 ng/ml、100 ng/ml、1 000 ng/ml組細胞穿膜數(shù)量依次為:42.5±7.8,39.6±5.4,24.7±6.1,16.2±4.5,與對照組細胞相比,AMD3100濃度100 ng/ml及1 000 ng/ml組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 AMD3100對Siha細胞遷徙能力的影響

劃痕愈合實驗結(jié)果圖見圖2。各組細胞24 h,48 h及72 h的劃痕愈合率見表2。與對照組相比,AMD3100濃度100 ng/ml及1 000 ng/ml組自24 h起劃痕愈合率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 AMD3100對Siha細胞CXCR4, Twist, E-cadherin蛋白表達的影響

不同濃度AMD3100處理后48 h各組細胞CXCR4, Twist, E-cadherin蛋白表達的情況見圖3。AMD3100處理后Siha細胞CXCR4, Twist蛋白的表達降低,E-cadherin蛋白的表達增高。AMD3100濃度為100 ng/ml及1 000 ng/ml與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A.對照組;B.10 ng/ml;C.100 ng/ml;D.1 000 ng/ml AMD3100圖1 AMD3100培養(yǎng)24 h對Siha細胞侵襲能力的影響 (×100)Figure 1 Effect of AMD3100 on invasion ability of Siha cells after culture for 24 h (×100)

表2各組細胞24h,48h及72h的劃痕愈合率(%)

Table2Therateofscratchhealingat24,48,72hinfourgroups(%)

組別24 h48 h72 h對照組39.57±4.5565.41±7.5690.07±7.9410 ng/ml37.26±7.2661.29±6.2785.40±9.52100 ng/ml20.17±5.29*29.82±7.11*35.36±6.97*1000 ng/ml10.55±2.82*12.72±3.69*13.21±3.07*

與同一時間點對照組相比,*P<0.05

與對照組相比，*P<0.05圖3 AMD3100對Siha細胞CXCR4,Twist,E-cadherin蛋白表達的影響Figure 3 Effect of AMD3100 on the expression of CXCR4, Twist and E-cadherin in Siha cells

3 討論

AMD3100是一種由人工合成的大環(huán)類CXCR4特異性拮抗劑[9],最初的研究表明其對HIV病毒具有抑制作用[10],在其抗HIV作用機制研究中意外發(fā)現(xiàn),AMD3100能特異性與CXCR4結(jié)合,阻斷CXCR4-SDF-1生物軸[11],從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[12],并且在炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[13]。

本研究采用MTT法觀察了CXCR4抑制劑AMD3100對Siha細胞增殖的影響,從MTT結(jié)果繪制的生長曲線可以看出,隨著AMD3100濃度的增加及作用時間的延長,Siha的抑制率逐漸增高,AMD3100的增殖抑制作用表現(xiàn)出一定的時間和濃度相關(guān)性,100 ng/ml自48 h開始,1 000 ng/ml自24 h開始,抑制率大于50%。侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤細胞最重要的惡性行為,也是腫瘤進展和死亡的重要原因,本研究采用包被基質(zhì)膠的Transwell小室和劃痕愈合模擬腫瘤細胞在體內(nèi)的侵襲遷移能力,結(jié)果顯示:經(jīng)AMD3100作用的Siha細胞通過基質(zhì)膠的能力顯著降低,劃痕后腫瘤細胞的生長速度和痕跡愈合率也顯著下降,說明AMD3100可顯著降低Siha細胞的侵襲和遷移能力,逆轉(zhuǎn)其惡性生物學(xué)行為。

腫瘤EMT發(fā)生的本質(zhì)為上皮細胞黏附性降低,向間葉組織表型轉(zhuǎn)化,其中E-cadherin蛋白的表達下調(diào)和Twist蛋白的表達上調(diào)是最常見的表型轉(zhuǎn)化現(xiàn)象[14]。Twist屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族,廣泛存在于人體各組織中,在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用[15],Twist可通過PI3K/Akt,Wnt/β-catenin,STAT3等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16],介導(dǎo)腫瘤性EMT,并且與腫瘤化療耐藥密切相關(guān),是目前較為關(guān)注的腫瘤治療靶點[17]。E-cadherin蛋白是介導(dǎo)上皮細胞間黏附作用的鈣離子依賴性跨膜蛋白,E-cadherin基因突變或表達缺失可導(dǎo)致細胞間黏附性降低,遷移能力增加,而其表達上調(diào)可降低腫瘤細胞的浸潤程度,保護腫瘤周圍基底膜、細胞基質(zhì)等組織屏障[18]。在腫瘤EMT發(fā)生過程中,E-cadherin蛋白的表達下調(diào)是最為常見的現(xiàn)象[19]。CXCR4可通過PI3K/Akt和ERK途徑誘導(dǎo)Twist上調(diào)、E-cadherin下調(diào),在EMT過程中發(fā)揮重要作用[20]。本研究結(jié)果表明:AMD3100處理后Siha細胞CXCR4,Twist蛋白的表達降低,E-cadherin蛋白的表達增高,可能通過影響上皮-間充質(zhì)相關(guān)蛋白的表達降低細胞增殖及侵襲能力。

總之,本研究結(jié)果表明CXCR4抑制劑AMD3100在體外可抑制Siha細胞增殖,降低其侵襲力,可能是通過影響EMT相關(guān)蛋白Twist,E-cadherin的表達發(fā)揮作用。