許敬平,吳大為,滕 旭,朱海英,李小麗,許培穎

(1秦皇島市第一醫(yī)院全科醫(yī)療科,秦皇島 066000;2河北港口集團(tuán)有限公司港口醫(yī)院腫瘤科;3河北醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室;4河北省實(shí)驗(yàn)動物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;5秦皇島市第一醫(yī)院康復(fù)中心;6吉林省公主嶺市中心醫(yī)院病理科;*通訊作者,E-mail:xjp_xd@hotmail.com)

心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)是一個復(fù)雜的病理生理過程,過度炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激均是MIRI的主要發(fā)病機(jī)制[1]。缺血再灌注(ischemia-reperfusion,IR)時心肌細(xì)胞存在凋亡和壞死,凋亡是影響梗死面積的重要因素,其中I/R早期心肌細(xì)胞凋亡的作用更加顯著。線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是普遍認(rèn)可的調(diào)控細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,其中ERS通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡反應(yīng)在最近幾年才被引起重視[2]。

吡格列酮為重要的過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARγ)激動劑,可通過減輕再灌注時心肌細(xì)胞的凋亡改善心功能,減輕MIRI時心肌梗死面積,但相關(guān)研究資料較少[3]。故而,本研究深入探討了PPARγ激動劑吡格列酮對大鼠I/R心肌細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制,現(xiàn)匯報如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

鹽酸吡格列酮片(15 mg,批號20132112)購于日本武田藥品株式會社,GRP78及caspase蛋白兔抗大鼠多克隆抗體購于南京凱基生物科技有限公司;羊抗兔SABC二抗購于北京博奧森公司;SOD、MDA、GSH-Px試劑盒均購于南京建成生物研究所;動物呼吸機(jī)(HX200)購于成都泰盟有限公司;酶標(biāo)儀(SAF-680T)、全自動生化分析儀(型號HT82-BTS-330)均購于美國BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及缺血再灌注模型建立

所有大鼠均為2周齡,購于山東魯抗有限公司,雄性6周齡Wistar大鼠48只,SPF級,平均體質(zhì)量(200.1±11.0)g,喂養(yǎng)于光照12 h、自由采食飲水、室溫23-25 ℃、相對濕度45%-60%的環(huán)境中。48只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、干預(yù)組,各16只,模型組和干預(yù)組建立缺血再灌注I/R模型,干預(yù)組采用吡格列酮10 mg/(kg·)進(jìn)行預(yù)處理,連續(xù)1周;模型組和假手術(shù)組僅給予等量[10 mg/(kg·)]生理鹽水[4]。

模型建立方法如下:干預(yù)組大鼠腹腔注射烏拉坦(5 ml/kg)麻醉,氣管插管后呼吸機(jī),潮氣量20 ml/kg,四肢皮下插電極描記心電圖,破胸膜、心包膜,剪斷肋骨,6-0絲線穿心肌淺層后絲線兩端由1 mm聚乙烯管穿出,血管鉗推壓小管左前降支,一并夾住絲線后阻斷冠脈血流后造成心肌缺血;假手術(shù)組僅于左冠狀動脈前降支穿線但不結(jié)扎,其他步驟同干預(yù)組。

1.3 大鼠血清指標(biāo)檢測

全自動生化分析儀檢測大鼠血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)水平;化學(xué)發(fā)光法檢測血漿肌鈣蛋白I(cTnI)、酶聯(lián)免疫法檢測心肌勻漿液中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量,實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 大鼠心肌細(xì)胞鈣含量檢測

心肌細(xì)胞放于6孔板中,每孔PBS清洗3次,鹽酸(0.6 mol/L)脫鈣4 h后取細(xì)胞,13 000 r/min,離心10 min,取上清檢測鈣含量,試驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 大鼠心肌細(xì)胞鈣凋亡檢測

所有大鼠再灌注2 h后開胸并取左室前壁心肌組織;甲醛固定,脫水、石蠟包埋后切片用于免疫組化分析和心肌細(xì)胞凋亡檢測。細(xì)胞凋亡率嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒說明書操作[5]。

1.6 大鼠心肌細(xì)胞GRP78及caspase蛋白檢測

SABC法檢測心肌細(xì)胞蛋白GRP78及caspase蛋白的表達(dá)情況,DAB顯色后蘇木精復(fù)染,封片鏡檢[6]。試驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌酶學(xué)指標(biāo)比較

模型組和干預(yù)組大鼠的CK-MB、LDH、cTnI水平均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05),干預(yù)組的CK-MB、LDH、cTnI水平顯著低于模型組(P<0.05,見表1)。

組別nCK-MB(U/L)LDH(U/L)cTnI(ng/ml)假手術(shù)組18 164.2±27.1984.6±220.10.862±0.114模型組 182118.5±339.2*1980.3±414.5*1.210±0.176*干預(yù)組 181392.0±177.5*#1440.6±317.5*#0.953±0.108*#

與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

2.2 大鼠心肌勻漿液MDA、SOD、GSH-Px測定值比較

模型組和干預(yù)組大鼠的心肌勻漿液MDA顯著高于假手術(shù)組(P<0.05),模型組和干預(yù)組大鼠的心肌勻漿液SOD、GSH-Px顯著低于假手術(shù)組(P<0.05);干預(yù)組大鼠的心肌勻漿液SOD、GSH-Px測定值顯著高于模型組(P<0.05),干預(yù)組大鼠的心肌勻漿液MDA顯著低于模型組(P<0.05,見表2)。

組別nMDA(nmol/mg) SOD(U/mg)GSH-Px(U/mg)假手術(shù)組1873.6±14.9 65.8±16.227.5±6.1模型組 18138.2±25.6* 29.0±9.4*7.9±2.4*干預(yù)組 18984.3±21.4*# 44.3±13.8*#16.8±4.4*#

與假手術(shù)組比較*P<0.05,與模型組比較,#P<0.05

2.3 大鼠心肌細(xì)胞鈣含量、心肌細(xì)胞凋亡率比較

模型組和干預(yù)組大鼠的心肌細(xì)胞鈣含量、心肌細(xì)胞凋亡率顯著高于假手術(shù)組(P<0.05),干預(yù)組大鼠的心肌細(xì)胞鈣含量、心肌細(xì)胞凋亡率顯著低于模型組(P<0.05,見表3)。

組別n心肌細(xì)胞中鈣含量(mmol/g)心肌細(xì)胞凋亡率(%)假手術(shù)組18 49.2±7.83.21±1.10模型組 18 83.6±15.1*14.92±4.19*干預(yù)組 18 58.5±12.0*#8.86±3.44*#

與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

2.4 大鼠心肌細(xì)胞蛋白GRP78及caspase蛋白比較

模型組和干預(yù)組大鼠的心肌細(xì)胞蛋白GRP78及caspase蛋白顯著高于假手術(shù)組(P<0.05),干預(yù)組大鼠的心肌細(xì)胞蛋白GRP78及caspase蛋白顯著低于模型組(P<0.05,見圖1，表4)。

圖1 心肌細(xì)胞蛋白GRP78及caspase蛋白的表達(dá)Figure 1 Cardiomyocyte protein GRP78 and caspase protein expression in three groups

表4大鼠心肌細(xì)胞蛋白GRP78及caspase蛋白比較

Table4ComparisonofratcardiomyocyteproteinGRP78andcaspaseproteinexpressionbetweenthreegroups

組別nGRP78蛋白caspase蛋白假手術(shù)組180.529±0.1140.557±0.132模型組 181.420±0.286*1.629±0.301*干預(yù)組 180.875±0.221*#0.904±0.251*#

與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3 討論

吡格列酮為PPARγ的重要配體,該受體是一種蛋白質(zhì),存在于胰島素敏感組織的脂肪、骨骼肌和肝臟組織中,可通過減輕再灌注時心肌細(xì)胞的凋亡改善心功能,減輕MIRI時心肌梗死面積[10]。吡格列酮作為新型PPARγ配體,能有效改善T2DM的胰島素抵抗和體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂,并抵抗抗動脈粥樣硬化。蘭天等[11]發(fā)現(xiàn)PPARγ可直接作用于Smad3,對TGF-β誘導(dǎo)的CTGF合成發(fā)揮抑制作用并抑制血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖而抵抗動脈粥樣硬化效應(yīng)。吡格列酮作用機(jī)制是高選擇性的激動過氧化物酶小體生長因子活化受體-γPPAR-γ 1,PPAR-γ的活化可調(diào)節(jié)許多控制葡萄糖及脂類代謝的胰島素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而發(fā)揮功效。

本研究結(jié)果顯示,模型組和干預(yù)組大鼠的CK-MB、LDH、cTnI水平均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05),干預(yù)組的CK-MB、LDH、cTnI水平顯著低于模型組(P<0.05)。cTnI是一種理想的心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志,心肌細(xì)胞因缺氧或缺血出現(xiàn)變性壞死時,cTnI通過破損細(xì)胞膜釋放入血[12]。因cTnI分子量較小并持續(xù)從變性細(xì)胞內(nèi)逸出,故急性心肌梗死發(fā)生后,在血中出現(xiàn)較早,并持續(xù)時間較長,該結(jié)果說明PPARγ激動劑發(fā)揮抑制心肌損傷、保護(hù)心功能的作用。

氧化應(yīng)激反應(yīng)與MIRI的關(guān)系密切,當(dāng)心肌組織出現(xiàn)缺血-再灌注時,自由基大量生成,生物膜被過氧化而出現(xiàn)功能和結(jié)構(gòu)損傷。SOD、GSH-Px和CAT均為構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)第一線的防御系統(tǒng)的內(nèi)源性抗氧化酶,可通過清除過量的活性氧抑制自由基損傷;MDA是脂質(zhì)過氧化作用的終產(chǎn)物,其含量能夠通過氧自由基對細(xì)胞的損傷程度做出間接反應(yīng)[13]。本研究結(jié)果顯示模型組和干預(yù)組大鼠的心肌勻漿液MDA顯著高于假手術(shù)組(P<0.05),模型組和干預(yù)組大鼠的心肌勻漿液SOD、GSH-Px顯著低于假手術(shù)組(P<0.05);干預(yù)組大鼠的心肌勻漿液SOD、GSH-Px測定值顯著高于模型組(P<0.05),干預(yù)組大鼠的心肌勻漿液MDA顯著低于模型組(P<0.05);這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)氧化應(yīng)激損傷在MIRI的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

Zhang等[14]研究發(fā)現(xiàn)ERS時可引起caspase蛋白的活化,并可通過聚集腫瘤壞死因子受體相關(guān)基因2在ER膜上的聚集。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)可結(jié)合未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)促進(jìn)新生蛋白質(zhì)的正確折疊,防止未折疊、錯誤折疊蛋白質(zhì)的聚集[15]。因而,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下GRP78和caspase蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)常被作為ERS激活的標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)模型組和干預(yù)組大鼠的心肌細(xì)胞蛋白GRP78及caspase蛋白顯著高于假手術(shù)組(P<0.05),干預(yù)組大鼠的心肌細(xì)胞蛋白GRP78及caspase蛋白顯著低于模型組(P<0.05)。模型組和干預(yù)組大鼠的心肌細(xì)胞鈣含量、心肌細(xì)胞凋亡率顯著高于假手術(shù)組(P<0.05),干預(yù)組大鼠的心肌細(xì)胞鈣含量、心肌細(xì)胞凋亡率顯著低于模型組(P<0.05)。上述結(jié)果證實(shí)證實(shí)凋亡參與了VSMC的鈣化過程,且與GRP78及caspase蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。PPARγ激動劑的使用可使GRP78及caspase蛋白表達(dá)下調(diào),減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的凋亡而發(fā)揮心肌保護(hù)作用,這也為吡格列酮的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

綜上所述,PPARγ激動劑對I/R模型大鼠心肌具有一定的保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與降低細(xì)胞中鈣含量、GRP78及caspase蛋白表達(dá)有關(guān)。