沈 成,王 龍*,康 文,潘 俠,王 晞

(1武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科,武漢 430060;2武漢大學(xué)心血管病研究所;*通訊作者,E-mail:wanglongwhu@163.com)

急性心肌梗死是心血管疾病中致死率最高的疾病[1]。目前,已有多種手段可以恢復(fù)心梗早期缺血再灌注降低心肌缺血造成的心肌損傷,但仍有部分患者難以避免地出現(xiàn)心肌壞死,導(dǎo)致致死性心律失常,心力衰竭的發(fā)生。因此,尋找心肌保護(hù)的途徑很有必要。

蝦青素(astaxanthin,AST)是一種廣泛存在于微生物和海洋生物中的類胡蘿卜素。已有研究表明,蝦青素能通過抗氧化應(yīng)激及抑制炎癥反應(yīng),增強(qiáng)心肌收縮指數(shù)和心肌細(xì)胞線粒體膜電位以保護(hù)受損心肌[2,3]。胱天蛋白酶-3(caspase-3)是半胱氨酸蛋白酶的家族成員之一,急性心肌梗死早期caspase-3受到體內(nèi)外各種因素刺激發(fā)生活化,而caspase-3的活化是心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆轉(zhuǎn)階段的關(guān)鍵步驟[4]。鑒于caspase-3在細(xì)胞凋亡中的特殊作用,且蝦青素在心梗大鼠的心肌保護(hù)作用是否與抑制caspase-3的活化相關(guān)未見具體報(bào)道。本研究通過建立大鼠急性心肌梗死模型,探討蝦青素對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡以及caspase-3活化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

蝦青素(SML0982-501,Sigma),TUNEL試劑盒(11684817910,Roche公司),SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(AS1012,ASPEN),RIPA總蛋白裂解液(AS1004,ASPEN),BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒(AS1086,ASPEN),ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(AS1059,ASPEN),Cleaved Caspase-3一抗(ab49822,abcam)。呼吸機(jī)(TKR 400H,特力),電生理記錄儀(MP150,BIOPAC),倒置顯微鏡(IX51,OLYMPUS),奧林巴斯顯微鏡成像系統(tǒng)(MicroPublisher,Q-IMAGING)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

6-8周齡雄性SD大鼠(購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào):SCXK(湘)2011-0003)25只,清潔級(jí),體質(zhì)量200-250 g。以一般飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,將大鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(n=5)、心梗組(n=10)、蝦青素組(n=10)。將蝦青素溶解于生理鹽水中,蝦青素組從心梗模型建立的第1天開始以5 mg/(kg·d)(SML0982-501,sigma)的蝦青素混懸液連續(xù)3 d(1次/d)灌胃大鼠,心梗組和假手術(shù)組給予等量生理鹽水。

1.3 大鼠心梗模型的建立

造模前大鼠禁食12 h,禁水4 h。腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30-40 mg/kg)麻醉,頸部及胸前剃毛,局部常規(guī)消毒。將四肢及門齒固定于操作臺(tái)上,四肢用針刺電極連接MP-150電生理記錄儀行術(shù)中心電監(jiān)測(cè)。在甲狀軟骨水平將頸部皮膚剪開一長(zhǎng)約1 cm切口,暴露氣管,插入自制氣管導(dǎo)管。注意氣管導(dǎo)管不要插入太深以防單肺通氣,插入角度不要太陡以防扎穿氣管,誤入食管。接通小動(dòng)物呼吸機(jī)行控制性機(jī)械輔助通氣,呼吸機(jī)設(shè)置參數(shù):呼吸頻率70次/min,吸呼比1 ∶1.5,潮氣量3.0 ml/kg。觀察氣道壓力以及呼吸動(dòng)度,保證大鼠呼吸回路通暢。在大鼠胸骨左緣約0.5 cm處縱行剪開皮膚,切口長(zhǎng)約3.0 cm,鈍性分離胸大肌,顯露助骨。斷開第3-4肋后用開瞼器撐開肋骨以顯露心臟。撕開心包膜,在左心耳下方約2 mm處以6/0縫線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支。結(jié)扎點(diǎn)以下心肌由紅變白、心尖搏動(dòng)減弱、MP-150心電監(jiān)護(hù)示ST段抬高時(shí)確認(rèn)心肌梗死模型制作成功。清理胸腔后逐層縫合胸壁肌肉關(guān)胸。待大鼠自主呼吸恢復(fù)且呼吸規(guī)律后撤離呼吸機(jī),保暖直至麻醉蘇醒,術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。假手術(shù)組在開胸后僅在冠狀動(dòng)脈下穿線而不結(jié)扎,其余步驟同上。

1.4 HE染色檢測(cè)心梗后心肌組織大體形態(tài)變化

心梗第3天處死大鼠后剪取心臟。用4 ℃生理鹽水反復(fù)沖洗心臟,除去右心室、左右心房以及大血管等多余組織。在結(jié)扎點(diǎn)處垂直于左心室長(zhǎng)軸方向?qū)⒆笮氖乙环譃槎?。將結(jié)扎點(diǎn)以下心肌用4%多聚甲醛溶液固定24 h,然后常規(guī)脫水、石蠟包埋,制備厚度4 μm的組織切片。

1.5 TUNEL法檢測(cè)心梗組織細(xì)胞凋亡

采用TUNEL法常規(guī)處理各組左心室石蠟標(biāo)本,實(shí)驗(yàn)步驟按照TUNEL試劑盒執(zhí)行。在每組5個(gè)200倍視野下統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)。正常心肌細(xì)胞呈藍(lán)色,凋亡心肌細(xì)胞胞核為熒光綠色。凋亡指數(shù)(AI):AI(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 Western Blot法檢測(cè)心臟梗死周邊區(qū)的活化的caspase-3含量

取材時(shí),將靠近結(jié)扎點(diǎn)附近的心肌組織通過肉眼區(qū)分心肌梗死區(qū)以及梗死周邊區(qū),剪下梗死周邊區(qū)心肌組織后,立即存入-80 ℃冰箱。用Western blot法檢測(cè)心臟梗死周邊區(qū)活化的caspase-3的表達(dá)。大鼠心肌梗死后的心臟通過肉眼觀察主要表現(xiàn)為結(jié)扎點(diǎn)以下梗死心肌變白、變薄,形成梗死瘢痕。變白、變薄區(qū)域稱為梗死區(qū)。梗死周邊區(qū)主要界定為梗死瘢痕外約1 mm以內(nèi)區(qū)域。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示:假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞包膜完整,心肌纖維走行整齊,無炎性細(xì)胞浸潤(rùn),心肌組織未見明顯病理改變。心梗組大鼠心肌細(xì)胞包膜不完整,排列紊亂,心肌組織細(xì)胞漿著色變深,心肌纖維斷裂伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與心梗組相比,蝦青素組大鼠心肌細(xì)胞變性程度以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度均有所減輕,可見斷裂的心肌纖維(見圖1)。

A.假手術(shù)組;B.心梗組;C.蝦青素組(心肌纖維呈紅色,細(xì)胞核呈藍(lán)色)圖1 心肌梗死第3天心臟組織HE染色 (×40)Figure 1 HE staining of heart tissue at day 3 after myocardial infarction (×40)

2.2 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)結(jié)果

TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示:假手術(shù)組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為(1.17±0.6)%,心梗組大鼠心肌梗死周邊區(qū)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為(69.53±14.87)%,蝦青素組心肌梗死周邊區(qū)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為(11.98±5.58)%。與假手術(shù)組比較,心梗組大鼠心肌梗死周邊區(qū)凋亡指數(shù)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。與心梗組比較,蝦青素組大鼠心肌梗死周邊區(qū)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)降低(見圖2),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。表明蝦青素可降低大鼠心肌梗死后梗死周邊區(qū)心肌細(xì)胞凋亡水平。

圖2 心肌梗死第3天TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 (×200)Figure 2 Myocardial cell apoptosis detected by TUNEL staining on the third day after myocardial infarction (×200)

2.3 心臟梗死周邊區(qū)活化的caspase-3蛋白表達(dá)及半定量分析

Western blot法檢測(cè)顯示:假手術(shù)組心臟梗死周邊區(qū)活化的caspase-3灰度值為0.09±0.02,心梗組心臟梗死周邊區(qū)活化的caspase-3灰度值為0.70±0.06;蝦青素組心臟梗死周邊區(qū)活化的caspase-3灰度值為0.29±0.09。與假手術(shù)組相比,心梗組大鼠心臟梗死周邊區(qū)活化的caspase-3含量顯著增加(P<0.05,見圖3);與心梗組比較,蝦青素組大鼠心肌梗死周邊區(qū)活化的caspase-3含量減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。

圖3 心肌組織梗死周邊區(qū)活化的caspase-3含量(n=5)Figure 3 The content of cleaved caspase-3 in the surrounding area of myocardial infarction(n=5)

3 討論

天然蝦青素是從海洋微生物雨生紅球藻中獲得的一種脂溶性類胡蘿卜素。蝦青素分子結(jié)構(gòu)兩端存在關(guān)鍵性的α-羥基酮結(jié)構(gòu)提高了其對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷的效率,并使其與自由基反應(yīng)的終產(chǎn)物更加穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn),蝦青素清除氧自由基及防止脂質(zhì)自氧化的效力是維生素C的6 000倍,輔酶Q10的800倍,維生素E的550倍[5,6]?，F(xiàn)已有關(guān)于蝦青素在心血管疾病治療方面的相關(guān)研究。Kumar等[7]研究發(fā)現(xiàn),蝦青素能通過降低高脂血癥大鼠血清中總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯、2-巰基苯甲酸水平,以及增加高密度脂蛋白膽固醇含量來改善高脂血癥大鼠的動(dòng)脈粥樣硬化狀態(tài)。研究人員發(fā)現(xiàn),蝦青素通過部分激活沉默調(diào)節(jié)蛋白1(sirtuin type1,SIRT1)信號(hào)通路以及抑制R-SMADs的乙?；瘻p輕由于心臟壓力負(fù)荷過重引起的小鼠心臟功能障礙和心肌纖維化[8]。Gross等[9]在大鼠心臟缺血/再灌注模型中觀察到,連續(xù)服用蝦青素可明顯縮小實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌梗死面積,增加心肌存活率以及降低血漿中脂肪酸氧化產(chǎn)物的含量。我國(guó)學(xué)者在犬心肌梗死模型中發(fā)現(xiàn),蝦青素能夠上調(diào)Nrf2的表達(dá),增加實(shí)驗(yàn)組犬血清中谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活力,從而增強(qiáng)其抗氧化能力并降低氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生,保護(hù)心肌細(xì)胞[10]。另有研究表明,蝦青素能激活Wnt/β連環(huán)蛋白信號(hào)通路來抑制細(xì)胞凋亡以及誘導(dǎo)血管生成[11]。

心肌細(xì)胞凋亡是各種心血管疾病走向終末階段的細(xì)胞分子基礎(chǔ)。在心肌細(xì)胞凋亡過程中,處于凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的caspase-3的活化是細(xì)胞凋亡過程中最為關(guān)鍵的一步。而在急性心肌梗死后,caspase-3的激活由于神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)激活后產(chǎn)生的內(nèi)源性過氧化物觸發(fā)[4]。據(jù)此可以合理推測(cè),抑制過氧化物的產(chǎn)生可以減少caspase-3活化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合已有關(guān)于蝦青素的抗氧化應(yīng)激能力在心血管疾病方面的保護(hù)作用,以及活化后的caspase-3在心梗后心肌細(xì)胞凋亡方面的作用的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行假設(shè)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

本研究通過結(jié)扎大鼠左前降支冠狀動(dòng)脈制備急性心肌梗死模型觀察到:急性心肌梗死大鼠食量減少,活動(dòng)耐量減低,部分大鼠出現(xiàn)口唇及四肢皮膚發(fā)紺現(xiàn)象。HE染色可見急性心梗大鼠心肌纖維斷裂,心肌細(xì)胞出現(xiàn)變性、壞死,心肌組織中有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。心臟梗死周邊區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)目以及活化的caspase-3含量均較假手術(shù)組增高。灌胃給予蝦青素后,蝦青素組大鼠心肌細(xì)胞變性程度與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度均減輕,心肌梗死周邊區(qū)心肌細(xì)胞凋亡程度和活化的caspase-3含量表達(dá)降低。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蝦青素可以抑制caspase-3的激活,降低心肌細(xì)胞凋亡程度,從而盡可能地挽救存活心肌,減少心肌梗死面積,保護(hù)心梗大鼠的心肌細(xì)胞。

在1999年美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)蝦青素作為膳食補(bǔ)充劑[12]。2003年,Spiller等[13]在關(guān)于蝦青素的安全性評(píng)估實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),口服蝦青素未對(duì)健康人血壓以及其余各項(xiàng)生化指標(biāo)產(chǎn)生影響。2008年,Miyawaki等[14]研究表明口服蝦青素不會(huì)對(duì)長(zhǎng)期使用阿司匹林的患者血小板凝聚功能和纖維蛋白溶解功能產(chǎn)生不良影響。蝦青素的高生物安全利用度以及抗氧化應(yīng)激能力在心血管方面的研究讓科研人員看到了蝦青素良好的開發(fā)價(jià)值。蝦青素的其他生物學(xué)應(yīng)用也值得廣大科研人員去探索。