郝廣婧，祁銀燕，朱春云

（青海大學(xué)a.青海省農(nóng)林科學(xué)院；b.青海高原林木遺傳育種實驗室；c.三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海 西寧 810016）

青海省柴達木盆地是我國枸杞原生地之一。盆地具有獨特的自然環(huán)境和高原氣候，孕育出珍稀植物資源——黑果枸杞Lycium ruthenicum Murr.。盆地晝夜溫差大，日照時間長，充足的光照環(huán)境誘導(dǎo)黑果枸杞在其漿果內(nèi)積累了花青素、多糖、多酚、維生素和礦物質(zhì)各種營養(yǎng)成分，尤其含有能清除自由基、具有抗氧化功能的花青素[1]。

黑果枸杞是重要的生態(tài)經(jīng)濟樹種[2]。成熟的黑果枸杞果實中富含花青素，有關(guān)藥理學(xué)的研究結(jié)果表明，這種黃酮類物質(zhì)具有很強的抗氧化能力[3-5]，能夠延緩衰老，同時能夠預(yù)防心血管疾病[6-7]、肥胖和糖尿病[6]；其果實中含有的多酚具有提高免疫力，調(diào)控人的情緒、促進人體腸道健康等功效[8]；多糖具有一定的抗氧化活性[9]，有降血糖和抗疲勞功能[10]。曾琳娜[11]研究提出，香茹多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒感染等功能。白鵬威[12]等人的研究結(jié)果也表明，果實的糖代謝和糖積累不僅與相關(guān)酶活性有關(guān)，也受遺傳因子、植物激素、生態(tài)因子的調(diào)控和影響。外在環(huán)境通過影響黑果枸杞果實內(nèi)相關(guān)代謝合成酶的活性來影響其營養(yǎng)物質(zhì)的代謝和積累，而且在果實生長發(fā)育的不同時期其不同部位的酶活性不同。光是一個很重要的環(huán)境因子，調(diào)控植物的生長、發(fā)育和新陳代謝[13-14]，是植物合成有機物的能源[15]，光照強度的大小可以直接影響到植物生長和活性成分的積累[16]。為了探究光照對黑果枸杞果實中主要活性成分含量的影響情況，以柴達木盆地的黑枸杞果實為研究材料，在其果實生長發(fā)育的不同時期對其分別進行了光處理與暗處理，分析了光照對黑果枸杞果實中主要活性成分含量的影響情況。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的植物材料為青海省柴達木盆地人工種植的黑果枸杞。

主要儀器設(shè)備：電子天平（BSA224S-CW）、電熱鼓風(fēng)干燥箱[DHG-9070(A) (101-1)]、紫外可見光光度計（N4S）、低溫離心機（5810R，Eppendorf）、渦旋振蕩器（XH-D，Thermo）。

1.2 實驗設(shè)計

本研究按黑果枸杞果實發(fā)育過程和顏色變化，將果實從幼果期到成熟期的整個發(fā)育時期劃分為5個時期（Stage）分別命名為S1、S2、S3、S4和S5（S-sample）：S1，果實為青綠色；S2，果實開始轉(zhuǎn)色，明顯附著紫色；S3，果實完全著紫色，開始膨大，硬度變小；S4，果實紫黑色，正在膨大；S5，果實黑色，完全膨大。本研究共設(shè)光處理與暗處理2個因素5個水平的兩兩對比處理。光處理：正常自然光照條件；暗處理：利用遮光袋模擬黑暗環(huán)境進行處理。分別對每個發(fā)育時期的果實進行套袋遮光處理，以正常光照條件下生長的黑果枸杞果實為對照，遮光處理10 d后分別測定果實內(nèi)花青素、多糖及多酚的含量。

1.3 樣品的處理與采集

1.3.1 樣品的處理

為了研究光照對黑果枸杞果實表型形態(tài)和果實內(nèi)主要活性成分的影響程度，我們分別采集了果實發(fā)育5個時期（S1—S5）遮光處理和自然光照條件（對照組）下生長的漿果進行研究，其中，L1～L5為5個時期自然光照條件下生長的漿果；D1～D5為5個時期遮光處理條件下生長的漿果，共采集了10組果實樣品，各組果實樣品的采集時間分別見表1。

表1 不同處理果實樣品的采集時間Table 1 Collection time of different processed fruit samples

1.3.2 樣品的采集

用剪刀分別剪下2個處理下5個時期的果實（帶果柄），采集時戴好手套，避免用手直接接觸果實，采摘后用錫紙包裹后置于液氮中冷凍，存于-80 ℃的冰柜中以備用。

1.4 測定項目與測定方法

1.4.1 花青素的測定

參考并改進汪洋、孫建霞等人有關(guān)花青素的提取方法[17-18]，準確稱取0.1 g黑果枸杞干粉，加入1% HCL/CH3OH（v/v）的混合液5 mL，于4 ℃條件下黑暗浸提24 h。然后，將混合液以4 ℃/10 000 r離心30 min，冷凍離心后，將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的10 mL離心管中，向剩余沉淀物中再加入1% HCL/CH3OH（v/v）的混合液2 mL，重懸后于4 ℃條件下黑暗浸提24 h并離心。合并上清液，定容至10 mL，充分振蕩后得到樣品溶液。利用紫外可見光光度計在最大吸收波長530 nm處[19]測定。試驗重復(fù)3次，測定值取3次技術(shù)重復(fù)的（平均值±標準差）。

1.4.2 多糖的測定

參考并改進劉曉涵等人[20]的苯酚硫酸法測定多糖。準確稱取0.1 g黑果枸杞干粉加入80%乙醇溶液5 mL，于60 ℃下水浴30 min，充分振蕩后將混合液以4 ℃/10 000 r離心30 min，冷凍離心后，將上清液轉(zhuǎn)移到25 mL的離心管中，將濾渣用相同提取工藝提取至濾液無表色，重復(fù)浸提2～3次后合并濾液定容。吸取2 mL置于10 mL的離心管中，在沸水浴中蒸干，準確加入10 mL蒸餾水，充分攪拌使糖溶解。以4 ℃/3 500 r離心5 min，取1 mL上清液稀釋50倍。精密加入5%苯酚溶液，搖勻后迅速加入硫酸5 mL，搖勻后常溫下放置10 min，置于40 ℃水浴中保溫20 min，取出后迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白。以紫外-可見光分光光度法，在490 nm的波長處測定吸光度，試驗重復(fù)3次，測定值取3次技術(shù)重復(fù)的（平均值±標準差）。

1.4.3 多酚的測定

參考GB/T8313-2008[21]中的茶多酚測定方法并加以改進，準確稱取0.1 g黑果枸杞干粉加入50%的CH3OH溶液10 mL，震蕩提取30 min。用超聲波提取40 min，4 ℃/9 000 r離心15 min。濾渣用相同提取工藝提取至濾液無表色。合并濾液定容至50 mL的容量瓶中，取1 mL提取液稀釋10倍，依次加入蒸餾水5.0 mL、10%的Filin-Ciocalteu試劑5 mL。充分震蕩后靜置3 min后，加入7.5%的Na2CO3溶液4.0 mL，搖勻，于35 ℃下恒溫水浴1.5 h。顯色后利用紫外可見光光度計在620 nm處測定并計算。試驗重復(fù)3次，測定值取3次技術(shù)重復(fù)的（平均值±標準差）。

2 結(jié)果與分析

利用SPSS 18.0對黑果枸杞主要活性成分的實驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2.1 果實表型形態(tài)分析

果實的色素種類和含量決定了果實顏色的多樣性。黑果枸杞在不同處理下各發(fā)育時期漿果的表型特征如圖1～4所示。從圖中可以看出，與對照組相比，在S1—S2時期遮光處理下的果實均有不同程度的褪色，且遮光處理下每個發(fā)育階段果實生長都比較緩慢，但個體差異并不是十分明顯的。

圖1 自然光照下不同發(fā)育時期的漿果（正面）Fig. 1 Different developmental stages under the light(positive)

圖2 遮光處理下不同發(fā)育時期的漿果（正面）Fig. 2 Different developmental stages under the dark (positive)

圖3 自然光照下不同發(fā)育時期的漿果（立面）Fig. 3 Different developmental stages under the light (fa?ade)

圖4 遮光處理下不同發(fā)育時期的漿果（立面）Fig. 4 Different developmental stages under the dark (fa?ade)

2.2 花青素含量分析

采用紫外分光光度計測定2個處理下黑果枸杞5個不同發(fā)育階段果實中花青素的含量，結(jié)果如表2。

表2 不同光照條件下黑果枸杞果實各生長時期其花青素含量的測定結(jié)果?Table 2 Anthocyanidin contents of Lycium ruthenicum Murr. in different stages under different light conditions

由表2可知，光處理和暗處理下黑果枸杞果實內(nèi)的花青素含量隨著果實的逐漸成熟均呈逐漸增加后減少的變化趨勢，從S1和S2這2個時期的測定結(jié)果可以看出，2個處理間存在差異，但差異不顯著；從S3、S4和S5此3個時期的測定結(jié)果可以看出，2個處理下果實內(nèi)的花青素含量均呈上升趨勢，且都在S5時期有所回落。但是，暗處理下果實內(nèi)花青素的含量會明顯低于光處理的果實，且光處理下黑果枸杞在S3時期果實內(nèi)的花青素含量就達到了5.02 mg·g-1，而此期暗處理下果實內(nèi)的花青素含量僅有0.50 mg·g-1，存在極顯著差異。

從表2中的花青素含量可以看出，2個處理下黑果枸杞果實內(nèi)的花青素含量均在S4時期最高，且暗處理下果實內(nèi)花青素的含量會略低于光處理，這一結(jié)果證明，光可能是影響花青素生物合成的關(guān)鍵環(huán)境因素之一，這為后續(xù)有關(guān)光誘導(dǎo)花青素生物合成深層分子機制的揭示奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.3 多糖含量分析

采用苯酚硫酸法對光處理及暗處理下不同發(fā)育時期黑果枸杞果實內(nèi)的多糖含量進行了測定，結(jié)果如表3。由表3可得，隨著黑果枸杞果實的逐漸成熟果實內(nèi)的多糖含量逐漸增加，在S1時期2個處理下果實內(nèi)多糖含量間就存在顯著性差異，而從S2到S5時期2個處理下黑果枸杞果實內(nèi)的多糖含量均一直呈極顯著差異，且在S3時期光處理下果實內(nèi)的多糖含量呈急速上升趨勢，而暗處理的果實在同一時期其多糖含量僅有2.39 mg·g-1，直到S4時期才出現(xiàn)急速上升趨勢。因此，光照可能對黑果枸杞果實內(nèi)枸杞多糖的積累有明顯影響。

表3 不同光照條件下黑果枸杞果實各生長時期其多糖含量的測定結(jié)果Table 3 Polysaccharides contents of Lycium ruthenicum Murr. in different stages under different light conditions

2.4 多酚含量分析

采用Folin-Ciocalteau法對光處理及暗處理下不同發(fā)育時期黑果枸杞果實內(nèi)的多酚含量進行了測定，結(jié)果如表4。由表4可得，光處理和暗處理下黑果枸杞果實內(nèi)的多酚含量均隨果實發(fā)育而逐漸增加。在S4時期其多酚含量均很高，隨后在S5時期又有所緩減，且2個處理下果實發(fā)育時期的變化趨勢相似，不存在顯著性差異。光照對黑果枸杞果實內(nèi)多酚的積累可能沒有很顯著的影響，對此研究結(jié)果（即光照對植物多酚有無影響的問題）我們還將進一步探討。

表4 不同光照條件下黑果枸杞果實各生長時期其多酚含量的測定結(jié)果Table 4 Polyphenol contents of Lycium ruthenicum Murr.in different stages under different light conditions

3 結(jié)論與討論

青海省柴達木盆地的黑果枸杞果實內(nèi)含有豐富的花青素，這使得黑果枸杞的營養(yǎng)價值遠高于紅果枸杞。而花青素的合成與代謝是一個復(fù)雜的過程，不僅與相關(guān)的酶活性有關(guān)，同時受植物發(fā)育階段和環(huán)境因素的調(diào)控[22]。目前，與植物發(fā)育和環(huán)境因素相關(guān)的花青素生物合成機制的影響因素仍不清楚。已有研究結(jié)果表明，光是影響花青素生物合成的關(guān)鍵環(huán)境因素之一[23]。在以前的許多研究中就提到花或果實中的花青素的積累是由強光誘導(dǎo)進行的，相比之下，在弱光或黑暗條件下，相關(guān)基因的表達被下調(diào)或抑制，這導(dǎo)致花青素在花和果實中的積累減少，從而產(chǎn)生白色或淺色的器官[24-27]。黑果枸杞中的枸杞多糖含量同樣也很高，其主要成分為鼠李糖和阿拉伯半乳糖聚糖。近年來，由于多糖具有來源廣以及抗氧化、降血脂、降血糖、抗菌多種活性功能的特點，所以有關(guān)枸杞多糖的研究已成為相關(guān)研究的熱點之一[28]。黑果枸杞含有的多糖具有多種生物活性和很高的藥用價值。白鵬威等人[6]研究提出，在一定條件下光照的減弱會減少植物果實內(nèi)多糖的積累；殷培蕾等人研究發(fā)現(xiàn)，光照不僅影響植物中多酚的種類和生物量，還會改變其抗氧化活性[29]。由此可見，光照不足會引起光合作用減弱，致使果實變小，最終會導(dǎo)致果實產(chǎn)量與品質(zhì)的減少和降低[30-32]。

本研究結(jié)果表明，遮光處理對黑果枸杞果實中花青素和枸杞多糖的積累均有顯著影響。在自然光照條件下，黑果枸杞果實內(nèi)的花青素含量范圍在0.14～8.99 mg·g-1之間，在遮光條件下果實內(nèi)的花青素含量只達到0.16～6.90 mg·g-1。另外，根據(jù)測定結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，在S3時期果實內(nèi)的花青素和多糖均有一個非常顯著的變化特點：此期自然光照條件下果實內(nèi)的花青素含量高達5.02 mg·g-1，相比S2時期呈現(xiàn)出急速增長的趨勢，而在遮光條件下同一時期果實內(nèi)的花青素含量僅有0.50 mg·g-1；同樣，在自然光照條件下生長的黑果枸杞其多糖含量已達到25.42 mg·g-1，相比S2時期的多糖含量呈現(xiàn)出激增趨勢，而在遮光條件下果實內(nèi)的多糖含量只有2.39 mg·g-1。這一測定結(jié)果說明，S3時期是花青素和多糖積累的一個非常關(guān)鍵的時期，在這個時期對花青素和多糖生物合成產(chǎn)生影響的相關(guān)環(huán)境因素會直接影響到當(dāng)年黑果枸杞果實的品質(zhì)，這也為以后的生產(chǎn)實踐提供了重要的理論研究基礎(chǔ)。相比之下，遮光處理的黑果枸杞在其他幾個時期果實內(nèi)花青素和多糖含量的變化都不明顯。殷培蕾等人在研究中提到，光照對苦蕎芽中多酚類物質(zhì)及抗氧化活性均有重要影響[29]；但在本研究中發(fā)現(xiàn)，遮光對黑果枸杞多酚積累并沒有顯著影響，對于檢測中沒有顯著影響的幾個結(jié)果，可能因為對遮光處理的時間和方法把握不準確，結(jié)論有一定的局限性。因此，下一步我們會在此次研究結(jié)果的基礎(chǔ)上對遮光處理的時間和方法進行改進，包括對黑果枸杞果實內(nèi)的多酚類型和含量作進一步的測定分析以及設(shè)置遮光時長梯度和遮光程度變化等，進一步確定光照影響黑果枸杞果實中有效活性成分積累的關(guān)鍵時期，從而為下一步對光誘導(dǎo)果實內(nèi)有效活性成分深層機理的揭示和珍稀資源特異種質(zhì)的合理利用及遺傳育種奠定重要理論基礎(chǔ)。

綜上所述，光照可能是影響黑果枸杞果實品質(zhì)優(yōu)良的決定性環(huán)境因素之一，遮光處理顯著降低了黑果枸杞的營養(yǎng)價值和果實品質(zhì)，與正常生長條件下的果實相比，表現(xiàn)出明顯的差異，這為以后對黑果枸杞的良種化培育和人工規(guī)?；耘嘁约氨Ｗo和持續(xù)利用這一寶貴資源提供了理論依據(jù)。