雷永平，鐘方麗，王曉林，陳 帥，陳鐸鑫

（吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022）

山刺玫屬于喜光的薔薇科小灌木，主要生長(zhǎng)在雜木林及山坡灌木中，其果實(shí)稱為刺玫果，屬于可在保健食品中添加的中藥材。刺玫果系薔薇科薔薇屬植物山刺玫Fruit of Rosa davurica Pall.的成熟果實(shí)，其味酸甜，具有濃郁的香甜氣息，廣泛分布于我國(guó)東北地區(qū)，其富含黃酮類、皂苷類等活性成分及維生素、氨基酸等物質(zhì)[1-3]，具有顯著的抗氧化、降血脂、降血糖、健腦增智、延年益壽等功效[4-6]，故其具有廣泛種植的價(jià)值[7-8]。

本課題組對(duì)刺玫果總黃酮、總皂苷的提取、純化工藝進(jìn)行了詳細(xì)研究[9-14]。市場(chǎng)上含有刺玫果的保健食品或中成藥其主要含量測(cè)定指標(biāo)為總黃酮，總黃酮具有抗氧化、增強(qiáng)人體免疫力等生理活性[15]。離子液體是在室溫下呈液體的有機(jī)離子體系，具有性質(zhì)穩(wěn)定、揮發(fā)性低、溶解能力強(qiáng)等獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑相比，具有綠色環(huán)保、不易燃燒等特點(diǎn)，其在天然植物活性成分提取領(lǐng)域已有所應(yīng)用[16-18]。因此，本研究采用離子液體輔助超聲技術(shù)，通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了刺玫果中木犀草素、金絲桃苷的提取工藝條件，為刺玫果的深入開發(fā)提供了試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試材：供試刺玫果采自吉林省吉林市豐滿區(qū)小白山，經(jīng)吉林化工學(xué)院藥學(xué)系薛健飛博士鑒定為薔薇科植物山刺玫Fruit of Rosa davurica Pall.的果實(shí)，樣品保存于吉林化工學(xué)院藥學(xué)系研究室。

試劑：木犀草素、金絲桃苷對(duì)照品，成都曼思特生物科技有限公司；氯化-1-丁基-3-甲基咪唑、溴化-1-丁基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽、1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽、1-丁基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽，上海成捷化學(xué)有限公司；甲醇、乙腈（色譜純），天津大茂化學(xué)試劑公司；水為重蒸餾水；其余所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1201型高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司；W5-100SP型恒溫水浴鍋， 上海申生科技有限公司；FA2004N型電子分析天平，上海精密科學(xué)儀有限公司；JBT/C-YCL型超聲波藥品處理機(jī)，濟(jì)寧金百特電子有限責(zé)任公司。

1.3 刺玫果提取液中木犀草素、金絲桃苷的HPLC含量的測(cè)定方法研究

以刺玫果提取液為原料，采用高效液相色譜法測(cè)定刺玫果提取液中木犀草素、金絲桃苷的峰面積，并對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)的確定、流動(dòng)相的選擇、線性關(guān)系的考察、重復(fù)性、精密度、供試品溶液的穩(wěn)定性、加樣回收率等進(jìn)行了試驗(yàn)研究。

1.4 刺玫果中木犀草素、金絲桃苷的提取工藝研究

稱取刺玫果粉適量，精密稱定，放入圓底燒瓶中，按照一定的料液比加入一定濃度的離子液體乙醇水溶液，放入超聲機(jī)中，設(shè)定適宜的水浴溫度和超聲波功率，提取一定時(shí)間，過濾，濾液轉(zhuǎn)移到50 mL的容量瓶中，定容，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按文中選定的色譜條件，分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定木犀草素、金絲桃苷的峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC含量測(cè)定方法的研究結(jié)果

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒質(zhì)量的木犀草素、金絲桃苷對(duì)照品各1.90 mg，置于10 mL的容量瓶中，加入甲醇使之溶解并定容至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為0.19 mg·mL-1的混合對(duì)照品貯備液。吸取上述混合對(duì)照品貯備液2.5 mL于25 mL的容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為19.00 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，置于冰箱中避光保存以備用[19]。

2.1.2 供試品溶液的制備

精密稱定5 g刺玫果粉，放入圓底燒瓶中，以一定的料液比加入離子液體乙醇水溶液，超聲提取，過濾，收集提取液[20-21]，轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶中并用乙醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.1.3 色譜條件及檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定木犀草素與其他黃酮類成分、金絲桃苷與其他黃酮類成分的含量時(shí)，一般可以在360 nm[22-23]的檢測(cè)波長(zhǎng)條件下測(cè)定，故本試驗(yàn)確定的檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。

色譜柱為大連依利特ODS2 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.2%磷酸溶液（V/V），程序?yàn)?～21 min，17% A；22～27 min，20%～24% A；28～36 min，28%～32% A；37～41 min，35%～45% A。流速為1.0 mL·min-1，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。在此條件下，木犀草素、金絲桃苷的保留時(shí)間分別為35.57、12.41 min。HPLC色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品溶液及供試品溶液的HPLC圖譜Fig. 1 HPLC chromatograms of reference solution(A) and sample solution(B)

2.1.4 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)中主要考察了甲醇-0.25%醋酸溶液、乙腈-0.25%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫各種流動(dòng)相對(duì)刺玫果提取液中木犀草素、金絲桃苷保留時(shí)間和分離度的影響情況。試驗(yàn)結(jié)果表明：適宜的流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫，能夠?qū)⒋堂倒崛∫褐械哪鞠菟?、金絲桃苷與其他物質(zhì)分開，故選擇在上述流動(dòng)相條件下進(jìn)行相關(guān)研究。另外，試驗(yàn)設(shè)計(jì)中原本準(zhǔn)備同時(shí)測(cè)定刺玫果提取液中的木犀草素、金絲桃苷、山柰酚，但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，刺玫果提取液中山柰酚的峰面積較小且不穩(wěn)定，所以在試驗(yàn)中只測(cè)定了木犀草素與金絲桃苷。

2.1.5 線性關(guān)系的考察

吸取木犀草素與金絲桃苷的混合對(duì)照品溶液，配制成質(zhì)量濃度分別為0.19、0.95、1.90、3.80、7.60、11.40、15.20 μg·mL-1的系列混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定木犀草素、金絲桃苷的峰面積[24]。以木犀草素、金絲桃苷對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量濃度C（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，各自的峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。木犀草素、金絲桃苷的回歸方程分別為：

Y＝102.01X＋12.02（r＝0.997 7）；

Y＝48.30 X＋6.96（r＝0.998 1）。

分析結(jié)果表明：木犀草素、金絲桃苷進(jìn)樣質(zhì)量濃度在0.19～15.20 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)刺玫果粉6份，按2.1.2中說明的方法制備供試品溶液，各進(jìn)樣量均為20 μL，測(cè)定木犀草素、金絲桃苷的峰面積。試驗(yàn)結(jié)果表明，供試品中木犀草素的峰面積分別為40.75、39.45、41.79、42.08、42.69、39.32 mv·min-1，RSD為3.43%；金絲桃苷的峰面積分別為33.28、35.22、35.04、35.16、35.22、36.48 mv·min-1，RSD為2.92%。這一結(jié)果表明，含量測(cè)定方法具有較好的重復(fù)性。

2.1.7 儀器精密度試驗(yàn)

吸取混合對(duì)照品及供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20 μL，分別測(cè)定對(duì)照品及供試品溶液中木犀草素、金絲桃苷的峰面積。試驗(yàn)結(jié)果表明：供試品中木犀草素的峰面積分別為42.72、42.80、45.24、42.39、46.20、43.65 mv·min-1，RSD為3.53%；金絲桃苷的峰面積分別為35.39、36.01、36.91、34.99、36.92、35.90 mv·min-1，RSD為2.18%。對(duì)照品中木犀草素的峰面積分別為1 756.98、1 789.63、1 854.15、1 733.21、1 789.83、1 761.12 mv·min-1，RSD為2.35%；金絲桃苷的峰面積分別為852.80、880.68、822.32、852.80、855.24、850.00 mv·min-1，RSD為2.18%。這一結(jié)果表明，儀器精密度符合要求。

2.1.8 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

吸取供試品溶液，分別放置0、1、2、3、4、5 h后，進(jìn)樣20 μL，測(cè)定木犀草素、金絲桃苷的峰面積。試驗(yàn)結(jié)果表明：供試品中木犀草素的峰面積分別為41.89、42.75、44.24、42.72、45.38、44.26 mv·min-1，RSD為2.98%；金絲桃苷的峰面積分別為35.60、36.41、36.86、34.81、35.49、35.94 mv·min-1，RSD為2.02%。這一結(jié)果表明，供試品溶液在室溫條件下放置5 h內(nèi)穩(wěn)定，能滿足測(cè)定的要求。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知木犀草素、金絲桃苷含量的刺玫果粉各6份，每份中加入濃度為19.00 μg·mL-1的木犀草素對(duì)照品溶液0.9 mL及濃度為38.00 μg·mL-1的金絲桃苷對(duì)照品溶液0.9 mL[25]，按照2.1.2中說明的方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，測(cè)定木犀草素、金絲桃苷的峰面積，測(cè)定結(jié)果見表1。表1表明：木犀草素的平均回收率為97.49%，RSD為1.76%；金絲桃苷的平均回收率為101.07%，RSD為1.83%。

2.2 離子液體輔助提取刺玫果中木犀草素、金絲桃苷工藝條件的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 離子液體類型的選擇

稱取5 g刺玫果粉，精密稱定，放入圓底燒瓶中，加入濃度為0.5 mol·L-1的不同離子液體的50%乙醇水溶液，離子液體分別為：溴化-1-丁基-3-甲基咪唑、氯化-1-丁基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽、1-丁基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽、1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽。放入超聲機(jī)中[26-27]，料液比為1∶16，設(shè)定水浴溫度50 ℃，超聲波功率180 W，提取30 min，過濾，濾液轉(zhuǎn)移到50 mL的容量瓶中，50%乙醇定容，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按2.1.3中的色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定木犀草素、金絲桃苷的峰面積。選擇試驗(yàn)結(jié)果見表2。表2表明，在5種離子液體中，1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽對(duì)木犀草素的提取效果最好，而氯化-1-丁基-3-甲基咪唑?qū)鸾z桃苷的提取效果最好，但氯化-1-丁基-3-甲基咪唑與1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽對(duì)金絲桃苷的提取效果接近。綜合考慮認(rèn)為，可選擇1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽為后續(xù)試驗(yàn)的離子液體。

表2 離子液體類型的選擇試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Selection of ionic liquids

2.2.1.2 提取溶劑的選擇

稱取5 g刺玫果粉，精密稱定，放入圓底燒瓶中，加入濃度為0.5 mol·L-1的1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽乙醇水溶液，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別設(shè)定為0%、10%、30%、50%、70%、90%，放入超聲機(jī)中，其他操作按2.2.1.1中所述方法進(jìn)行，測(cè)定木犀草素、金絲桃苷的峰面積，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在0%～70%范圍內(nèi)時(shí)，木犀草素、金絲桃苷的峰面積均隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，金絲桃苷的峰面積達(dá)到了最大值，而木犀草素的峰面積也接近最高值；繼續(xù)提高乙醇體積分?jǐn)?shù)，金絲桃苷的峰面積明顯下降，而木犀草素峰面積的變化不明顯。究其原因，可能是木犀草素為黃酮苷元，難溶或不溶于水，主要溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑中；而金絲桃苷為黃酮苷，在水中的溶解度大于木犀草素，所以，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較高時(shí)，其對(duì)黃酮苷元木犀草素的提取效果比較理想，但對(duì)黃酮苷金絲桃苷的提取效果很差。綜合考慮認(rèn)為，可選擇70%乙醇水溶液為后續(xù)試驗(yàn)的提取溶劑。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)峰面積的影響Fig. 2 The influence of ethananol volume fraction on the peak of luteolin、Hyperoside

2.2.1.3 離子液體濃度的選擇

稱取5 g刺玫果粉，精密稱定，放入圓底燒瓶中，加入濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mol·L-1的1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽70%乙醇水溶液，放入超聲機(jī)中[28]，其他操作按2.2.1.1中所述方法進(jìn)行，測(cè)定木犀草素、金絲桃苷的峰面積，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)離子液體濃度在0.05～0.40 mol·L-1范圍內(nèi)，隨著離子液體濃度的增加，木犀草素、金絲桃苷的峰面積均不斷提高，而當(dāng)離子液體濃度達(dá)到0.4 mol·L-1時(shí)，二者的峰面積均達(dá)到最高值；繼續(xù)增加離子液體濃度，二者的峰面積均略有下降，但其變化均不明顯。分析其原因，可能是隨著離子液體濃度的升高，其溶解能力增強(qiáng)，所以，最初二者的峰面積均隨離子液體濃度的增加而提高，但離子液體濃度越高，溶液的粘度也就越大，溶劑滲透進(jìn)藥材基質(zhì)內(nèi)的能力越小，故當(dāng)離子液體濃度高于0.4 mol·L-1時(shí)，隨著離子液體濃度的增加，二者的峰面積不再持續(xù)提高，而均呈略有下降的趨勢(shì)。

2.2.1.4 料液比的選擇

圖3 離子液體濃度對(duì)峰面積的影響Fig. 3 The influence of ionic liquid concentration on the peak of luteolin、Hyperoside

稱取5 g刺玫果粉，精密稱定，放入圓底燒瓶中，加入濃度為0.4 mol·L-1的1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽70%乙醇水溶液，放入超聲機(jī)中，料液比分別設(shè)定為1∶7、1∶10、1∶13、1∶16、1∶19、1∶22、1∶25（g∶mL），其他操作按2.2.1.1中所述方法進(jìn)行，測(cè)定木犀草素、金絲桃苷的峰面積，試驗(yàn)結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著料液比的增加，木犀草素、金絲桃苷的峰面積均逐漸增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶22時(shí)，木犀草素的峰面積達(dá)到最高值，而金絲桃苷的峰面積也達(dá)到了較高值（66.55 mv·min-1）；繼續(xù)加大料液比，木犀草素的峰面積則略有降低，而金絲桃苷的峰面積卻稍有增加，但其變化均較小。究其原因，可能是刺玫果的量固定，在一定范圍內(nèi)增加提取溶劑的用量，會(huì)使刺玫果中的木犀草素、金絲桃苷更好地轉(zhuǎn)移到溶劑中，所以，當(dāng)料液比為1∶22時(shí)，刺玫果中的木犀草素、金絲桃苷幾乎全部被溶出，如果料液比繼續(xù)增大，刺玫果中木犀草素、金絲桃苷的溶出變化就不明顯了。綜合考慮認(rèn)為，可選擇1∶22為后續(xù)試驗(yàn)的料液比。

圖4 料液比對(duì)峰面積的影響Fig. 4 The influence of liquid-solid ratio on the peak of luteolin、Hyperoside

2.2.1.5 提取水浴溫度的選擇

稱取5 g刺玫果粉，精密稱定，放入圓底燒瓶中，加入濃度為0.4 mol·L-1的1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽70%乙醇水溶液，放入超聲機(jī)中，料液比設(shè)定為1∶22，提取水浴溫度分別設(shè)定為30、40、50、60、70、80 ℃，其他操作按2.2.1.1中所述方法進(jìn)行，測(cè)定木犀草素、金絲桃苷的峰面積，試驗(yàn)結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著水浴溫度的提高，木犀草素、金絲桃苷的峰面積均逐漸增加，當(dāng)水浴溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，二者的峰面積均達(dá)到了最高值。分析其原因，可能是隨著水浴提取溫度的不斷升高，提取溶劑的運(yùn)動(dòng)速度不斷增大，當(dāng)水浴溫度提高到80 ℃時(shí)，提取溶劑處于微沸狀態(tài)，此時(shí)溶劑滲透到刺玫果組織細(xì)胞中的能力最強(qiáng)。所以，選擇水浴提取溫度為80 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖5 提取溫度對(duì)峰面積的影響Fig. 5 The influence of extraction tempreature on the peak of luteolin、Hyperoside

2.2.1.6 提取時(shí)間的選擇

稱取5 g刺玫果粉，精密稱定，放入圓底燒瓶中，加入濃度為0.4 mol·L-1的1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽70%乙醇水溶液，放入超聲機(jī)中，料液比設(shè)定為1∶22，提取水浴溫度為80 ℃，提取時(shí)間分別設(shè)定為5、10、15、20、30、40、50、60、75、90 min，其他操作按2.2.1.1中所述方法進(jìn)行，測(cè)定木犀草素、金絲桃苷的峰面積，試驗(yàn)結(jié)果見圖6。由圖6可知，隨著提取時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，木犀草素、金絲桃苷的峰面積均不斷增加，當(dāng)提取時(shí)間從5 min 增加到60 min時(shí)，二者的峰面積均明顯增加，當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)到75 min時(shí)，二者的峰面積均略有增加；但若繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，木犀草素的峰面積反而出現(xiàn)下降趨勢(shì)，而金絲桃苷的峰面積略有增加，但其變化均不明顯。分析其原因，可能是提取時(shí)間越長(zhǎng)，越有利于木犀草素、金絲桃苷的溶出，但如果提取時(shí)間過長(zhǎng)則會(huì)使雜質(zhì)溶出增加，可能會(huì)對(duì)二者的測(cè)定有一定的影響。綜合考慮認(rèn)為，選擇75 min為后續(xù)試驗(yàn)的提取時(shí)間。

2.2.1.7 超聲波功率的選擇

圖6 提取時(shí)間對(duì)峰面積的影響Fig. 6 The influence of extraction time on the peak of luteolin、Hyperoside

稱取5 g刺玫果粉，精密稱定，放入圓底燒瓶中，加入濃度為0.4 mol·L-1的1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽70%乙醇水溶液，放入超聲機(jī)中，超聲波功率分別為100、120、140、160、180 W，料液比為1∶22（g∶mL），提取水浴溫度設(shè)定為80 ℃，其他操作按2.2.1.1中所述方法進(jìn)行，測(cè)定木犀草素、金絲桃苷的峰面積。試驗(yàn)結(jié)果見圖7，由圖7可知，隨著超聲波功率的不斷增加，木犀草素、金絲桃苷的峰面積不斷增加，當(dāng)超聲波功率繼續(xù)提高到最高值時(shí)，二者的峰面積均達(dá)到了最大值。分析其原因，可能因?yàn)殡S著超聲波功率的提高，超聲波對(duì)刺玫果細(xì)胞的破碎程度不斷增大，從而加速了木犀草素、金絲桃苷的溶解。

圖7 超聲波功率對(duì)峰面積的影響Fig. 7 The influence of ultrasonic power on the peak of luteolin、Hyperoside

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，將提取水浴溫度固定為80 ℃，超聲波功率固定為180 W，選擇提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)、離子液體濃度、料液比、提取時(shí)間作為考察因素，按四因素三水平進(jìn)行試驗(yàn)，正交試驗(yàn)的因素與水平見表3，正交試驗(yàn)結(jié)果分別見表4與表5。

正交試驗(yàn)結(jié)果表明：離子液體超聲輔助提取玫果木犀草素的最優(yōu)方案為A3B3C3D1，各因素的影響大小為：離子液體濃度＞提取時(shí)間＞料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。而提取刺玫果金絲桃苷的最優(yōu)方案為A2B3C3D3，各因素的影響大小為：料液比＞提取時(shí)間＞離子液體濃度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)?？紤]到乙醇體積分?jǐn)?shù)無論對(duì)提取木犀草素還是提取金絲桃苷的影響都最小，從生產(chǎn)成本上考慮，可選擇70%乙醇水溶液為提取溶劑；而考慮到提取時(shí)間對(duì)二者峰面積之和的影響情況，選擇超聲提取時(shí)間為90 min。最終確定的離子液體超聲輔助同時(shí)提取刺玫果木犀草素及金絲桃苷的最優(yōu)方案為A2B3C3D3，即離子液體為1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽、離子液體濃度為0.45 mol·L-1、料液比為1∶25、提取溶劑為70%乙醇水溶液、提取時(shí)間為90 min、提取溫度為80 ℃，超聲波功率為180 W。

表3 正交試驗(yàn)的因素與水平Table 3 The table of factors and levels

表4 離子液體超聲輔助提取刺玫果中木犀草素的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal array design arrangement and the experimental data

表5 離子液體超聲輔助提取刺玫果中金絲桃苷的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal array design arrangement and the experimental data

2.2.3 工藝驗(yàn)證性試驗(yàn)

稱取刺玫果粉3份，每份5 g，精密稱定，放入圓底燒瓶中，加入濃度為0.45 mol·L-1的1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽70%乙醇水溶液，放入超聲機(jī)中，料液比為1∶25，設(shè)定水浴溫度為80 ℃，超聲波功率180 W，提取時(shí)間90 min，過濾，濾液轉(zhuǎn)移到50 mL的容量瓶中，70%乙醇定容，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按照2.1.3中所述的色譜條件，分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定木犀草素、金絲桃苷的峰面積。3次試驗(yàn)結(jié)果均表明：木犀草素的峰面積分別為135.58、131.28、136.13 mv·min-1，其平均值為134.33 mv·min-1，RSD 均為1.98%；金絲桃苷的峰面積分別為131.18、126.83、130.28 mv·min-1，其平均值為129.46 mv·min-1，RSD均為1.77%。這一驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果表明，在優(yōu)化的提取條件下，木犀草素、金絲桃苷的提取率分別為11.99、25.36 μg·g-1，且優(yōu)選的離子液體超聲輔助提取工藝比較穩(wěn)定。

2.2.4 離子液體輔助提取刺玫果中木犀草素、金絲桃苷的對(duì)比試驗(yàn)

稱取刺玫果粉3份，每份5 g，精密稱定，放入圓底燒瓶中，加入70%乙醇水溶液，放入超聲機(jī)中，料液比為1∶25，設(shè)定水浴溫度為80 ℃，超聲波功率180 W，提取時(shí)間90 min，過濾，濾液轉(zhuǎn)移到50 mL的容量瓶中，70%乙醇定容，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按照2.1.3中所述色譜條件，分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定木犀草素、金絲桃苷的峰面積。提取體系中不加入離子液體，其他操作條件與2.3.3中所述相同，3次試驗(yàn)結(jié)果均表明：木犀草素的峰面積分別為104.80、98.10、101.49 mv·min-1，其平均值為101.43 mv·min-1，其提取率為8.76 μg·g-1；金絲桃苷的峰面積分別為92.28、86.58、88.46 mv·min-1，其平均值為89.11 mv·min-1，其提取率為17.01 μg·g-1。根據(jù)2.3.3中所述的試驗(yàn)結(jié)果可知，離子液體的加入使木犀草素峰面積提高了32.44%、提取率提高了36.87%；使金絲桃苷峰面積提高了45.28%，提取率提高了49.09%。

3 結(jié)論與討論

（1）本試驗(yàn)對(duì)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定刺玫果中木犀草素、金絲桃苷含量的測(cè)定方法進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，所建立的測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便，精密度高，重復(fù)性及線性關(guān)系均良好，木犀草素、金絲桃苷的平均回收率分別為97.49%、101.07%。

（2）本試驗(yàn)采用超聲波輔助離子液體法對(duì)刺玫果中的木犀草素、金絲桃苷進(jìn)行了提取，試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳提取工藝為：離子液體濃度為0.45 mol·L-1，料液比為1∶25，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為90 min，超聲波功率180 W。在此優(yōu)化的提取條件下，木犀草素、金絲桃苷的提取率分別為11.99、25.36 μg·g-1。這比王正軍[29]等人對(duì)刺玫果中金絲桃苷的提取效果有顯著的提高。

（3）提取體系中不加入離子液體，試驗(yàn)結(jié)果表明，木犀草素的峰面積平均值為101.43 mv·min-1，其提取率為8.76 μg·g-1；金絲桃苷的峰面積平均值為89.11 mv·min-1，其提取率為17.01 μg·g-1。離子液體的加入使木犀草素峰面積提高了32.44%、提取率提高了36.87%；使金絲桃苷峰面積提高了45.28%，提取率提高了49.09%。

（4）試驗(yàn)結(jié)果表明，添加有離子液體的乙醇水溶液所提木犀草素、金絲桃苷的提取率比純乙醇水溶液的高，這可能因?yàn)?，離子液體對(duì)植物纖維素的溶解能力較高，有利于目標(biāo)成分的溶出，從而使提取率提高。該方法具有快速、高效、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，試驗(yàn)結(jié)果為刺玫果活性成分的提取提供了一種新方法。