鄧全恩，丁向陽，李建安

（1. 中南林業(yè)科技大學(xué) a.經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.經(jīng)濟(jì)林培育與利用湖南省2011協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410004； 2. 河南省林業(yè)科學(xué)研究院，河南 鄭州 450008）

油茶Camellia oleifera Abel.屬山茶科Theaceae山茶屬Camellia L.常綠灌木或中喬木，是指山茶科山茶屬植物中油脂含量較高且具有栽培經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一類植物的總稱[1]。茶油的不飽和脂肪酸含量超過90%，其食用與保健品質(zhì)遠(yuǎn)超常規(guī)食用油，被譽(yù)為“東方橄欖油”[2-3]。近年來，油茶作為最具代表性和發(fā)展?jié)摿Φ哪颈臼秤糜土蠘浞N受到國家和地方各級政府的高度重視，種植區(qū)域逐漸擴(kuò)大，而作為傳統(tǒng)的南方樹種，在原產(chǎn)地的發(fā)展?jié)摿τ邢?，所以油茶新造林區(qū)域逐漸北移，在湖北省、安徽省北部及河南省南部的油茶生長北緣地區(qū)發(fā)展迅速。發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)不僅能獲得經(jīng)濟(jì)效益，還能兼獲生態(tài)效益和社會(huì)效益，符合我國脫貧攻堅(jiān)和生態(tài)發(fā)展的政策導(dǎo)向。

油茶在我國已有2 300多年的栽培歷史，主要分布在我國中南部地區(qū)（18°21′～34°34′ N、98°40′～121°40′ E），集中分布在湖南、江西、廣西、浙江、福建等省區(qū)[4]。油茶喜溫，要求年平均氣溫16～18 ℃，花期平均氣溫12～13 ℃[5]。近年來，專家學(xué)者對油茶的抗寒性進(jìn)行了諸多研究，涉及到的研究方向和方法包括葉片石蠟切片觀測葉片組織結(jié)構(gòu)與抗寒的關(guān)系[6]、以生理生化指標(biāo)評價(jià)油茶品種抗寒性的研究[7-11]、油茶抗寒分子的初步研究[12]、油茶生長北限抗寒品種及優(yōu)良單株的選育[13-14]及提高油茶抗寒能力措施的研究等方面[15]。為給將來河南省油茶良種的選育、引種及栽培區(qū)劃提供理論依據(jù)，對河南省主要油茶栽培品種抗寒性差異及生理機(jī)理進(jìn)行了研究，現(xiàn)將研究結(jié)果分析報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為6～8年生、長勢良好的‘長林4號’‘長林40號’‘長林27號’‘XL210’‘大別山1號’‘豫油茶1號’等普通油茶品種，分別種植于河南省信陽市的光山縣、新縣和商城縣。

1.2 方 法

于2018年1月取健康結(jié)果枝的第3～4片成熟葉片。將葉片用去離子水洗凈后均分成6 份，分別置于低溫恒溫槽進(jìn)行低溫脅迫處理，處理溫度分別設(shè)為0、-5、-10、-15 和 -20 ℃，共設(shè)5個(gè)溫度梯度。低溫處理12 h 后將材料取出放入冰箱（4 ℃）解凍24 h，解凍后將每組平均分成3份，每份3次重復(fù)，測定各組材料的相對電導(dǎo)率、游離脯氨酸、丙二醛、可溶性蛋白含量等生理指標(biāo)。

相對電導(dǎo)率（REC），采用電導(dǎo)率儀法進(jìn)行測定。擬合Logistic方程，確定各植株的LT50，以測得的電導(dǎo)率計(jì)算相對電導(dǎo)率；并擬合 Logistic回歸方程：y＝k/(1＋ae－bx)。式中的k為細(xì)胞傷害率飽和容量，根據(jù)陳建勛[16]的觀點(diǎn)，如果y為累計(jì)頻率，則常數(shù)k為100%；a、b為方程參數(shù)，將方程進(jìn)行線性化處理，求得a、b值，用曲線的拐點(diǎn)作為半致死溫度，即X＝-lna/b，即半致死溫度。丙二醛含量，采用硫代巴比妥酸（TBA）法進(jìn)行測定；游離脯氨酸含量，采用酸性茚三酮顯色法進(jìn)行測定；可溶性蛋白含量，采用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法進(jìn)行測定[17]。

采用隸屬函數(shù)值法綜合評價(jià)不同普通油茶品種的抗寒性。如果抗寒指標(biāo)與抗寒性呈正相關(guān)，則其計(jì)算公式為：

U(Xi)＝(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)。

如果抗寒指標(biāo)與抗寒性呈負(fù)相關(guān)，則計(jì)算公式為：

U(Xi)＝1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)。

式中：U(Xi) 是 i 樣品某個(gè)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；X代表i樣品某個(gè)指標(biāo)均值；Xmax是所有材料中某個(gè)指標(biāo)的最大值；Xmin是所有材料中某個(gè)指標(biāo)的最小值。將每個(gè)樹種越冬期間各指標(biāo)的抗寒性隸屬函數(shù)值累加起來，求其平均值，均值越大則表明其抗寒性越強(qiáng)[18]。

分別使用軟件Excel 2010和SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算、Logistic 擬合及差異性分析，使用軟件Origin Pro 9.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對不同油茶品種電導(dǎo)率的影響

低溫脅迫下不同油茶品種葉片相對電導(dǎo)率的變化情況如圖1A所示。由圖1A可知，油茶葉片相對電導(dǎo)率隨脅迫加強(qiáng)而逐漸升高，即電導(dǎo)率和脅迫溫度呈負(fù)相關(guān)，電導(dǎo)率在20%～80%之間，說明隨著溫度降低，油茶葉片細(xì)胞膜受到的傷害逐漸增強(qiáng)。6個(gè)油茶品種在低溫脅迫下其電導(dǎo)率的變化規(guī)律基本一致，同一品種在不同低溫脅迫下的電導(dǎo)率存在顯著差異（P＜0.05），不同品種在同一溫度脅迫下的電導(dǎo)率也均存在顯著差異（P＜0.05）。電導(dǎo)率隨著溫度降低而變化的過程基本可以分為3個(gè)階段：0～-5 ℃脅迫下，電導(dǎo)率緩慢升高；-5～-10 ℃脅迫下，電導(dǎo)率則大幅升高；-10～20 ℃脅迫下，電導(dǎo)率的增幅又減緩，基本趨于停滯狀態(tài)；其總體上呈現(xiàn)“S”形的變化趨勢。從圖1A中可以看出，長林系列油茶和‘XL210’品種油茶的電導(dǎo)率較為接近，明顯高于‘大別山1號’和‘豫油茶1號’，說明前4個(gè)油茶品種的抗寒性不如后2個(gè)油茶品種的強(qiáng)，‘大別山1號’的抗寒性最強(qiáng)，‘長林4號’的抗寒性最弱。

以油茶葉片相對電導(dǎo)率擬合的 Logistic方程求得的半致死溫度見表1。由表1可知，擬合度在0.95～0.98 之間，均達(dá)到極顯著水平?！L林4號’‘長林40號’‘長林27號’‘XL210’‘大別山1號’‘豫油茶1號’的低溫半致死溫度分別為-6.31、-8.30、-7.51、-8.34、-9.92、-8.72 ℃。

表1 河南省不同油茶栽培品種葉片的低溫半致死溫度?Table 1 The parameters of LT50 dynamics of of Camellia oleifera in Henan province

2.2 低溫脅迫對不同油茶品種丙二醛含量的影響

低溫脅迫下不同油茶品種葉片丙二醛含量的變化情況如圖1B所示。由圖1B可知，油茶葉片丙二醛含量隨脅迫加強(qiáng)而逐漸升高。低溫脅迫下6個(gè)油茶品種葉片丙二醛含量的變化規(guī)律基本一致，同一品種在不同低溫脅迫下和不同品種在同一溫度脅迫下葉片的丙二醛含量間均存在顯著差異（P＜0.05）。丙二醛含量隨著溫度降低而變化的過程基本可以分為3個(gè)階段：0～-5 ℃脅迫下，丙二醛含量緩慢升高；-5～-10 ℃脅迫下，其含量大幅升高；-10～-20 ℃脅迫下，其增幅又減緩，基本趨于停滯狀態(tài)；總體上呈現(xiàn)“S”形變化趨勢。從圖1B中可以看出，長林系列油茶和‘XL210’品種油茶葉片丙二醛的含量較為接近，明顯高于‘大別山1號’和‘豫油茶1號’，說明前4個(gè)油茶品種的抗寒性不如后2個(gè)油茶品種的強(qiáng)，‘大別山1號’的抗寒性最強(qiáng)，‘長林4號’的抗寒性最弱。

2.3 低溫脅迫對不同油茶品種游離脯氨酸含量的影響

低溫脅迫下不同油茶品種葉片游離脯氨酸含量的變化情況如圖1C所示。由圖1C可知，不同油茶品種葉片的游離脯氨酸含量均隨溫度的降低而升高，同一品種在不同低溫脅迫下和不同品種在同一溫度脅迫下葉片的游離脯氨酸含量也均存在顯著差異（P＜0.05）。其含量變化過程同樣經(jīng)歷了3個(gè)階段，但和電導(dǎo)率變化趨勢不同的是：0～-5 ℃脅迫下，游離脯氨酸含量迅速升高；-5～-15 ℃脅迫下，其含量緩慢增長；-15～-20 ℃脅迫下，其含量迅速增高。不同品種葉片的游離脯氨酸含量均隨溫度的降低而增加，其變化規(guī)律和電導(dǎo)率的相反。從圖1C中可以看出，長林系列油茶和‘XL210’品種油茶葉片的游離脯氨酸含量較為接近，明顯低于‘大別山1號’和‘豫油茶1號’，說明前4個(gè)油茶品種的抗寒性不如后2個(gè)油茶品種的強(qiáng)，‘大別山1號’的抗寒性最強(qiáng)，‘長林4號’的抗寒性最弱。

2.4 低溫脅迫對不同油茶品種可溶性蛋白含量的影響

低溫脅迫下不同油茶品種葉片可溶性蛋白含量的變化情況見圖1D。由圖1D可知，油茶葉片可溶性蛋白含量隨溫度的降低呈先升后降的變化趨勢，其變化過程大致可分為4個(gè)階段：0～-5 ℃脅迫下，可溶性蛋白含量緩慢增加；-5～-10 ℃脅迫下，其含量迅速增加并達(dá)到最大值，隨后下降；10～-15 ℃脅迫下，其含量緩慢下降；-15～-20 ℃脅迫下，其含量迅速下降，但還是高于0 ℃脅迫下的測定值。同一品種在不同低溫脅迫下和不同品種在同一溫度脅迫下其丙二醛含量間也均存在顯著差異（P＜0.05）。由圖1D可見，長林系列油茶和‘XL210’品種油茶葉片的可溶性蛋白含量較為接近，明顯低于‘XL210’‘大別山1號’和‘豫油茶1號’，說明前3個(gè)油茶品種的抗寒性不如后3個(gè)油茶品種的強(qiáng)，‘大別山1號’的抗寒性最強(qiáng)，‘長林4號’的抗寒性最弱。

2.5 抗寒性綜合評價(jià)

植物的抗寒機(jī)制由多種物質(zhì)共同調(diào)節(jié)，僅用一種指標(biāo)很難準(zhǔn)確反映植物的抗寒性。隸屬函數(shù)法可以將多個(gè)抗性指標(biāo)綜合起來，以平均隸屬度來評價(jià)植物的抗寒性。平均隸屬度越大，說明植物的抗寒性越強(qiáng)。低溫脅迫下不同油茶品種各抗寒指標(biāo)的隸屬函數(shù)值見表2。由表2可知，‘大別山1號’的平均隸屬度（0.513 6）最高，‘長林4號’的平均隸屬度（0.416 8）最低，其他4個(gè)油茶品種的平均隸屬度均居中。此結(jié)果與其LT50的計(jì)算結(jié)果一致。

圖1 河南主要油茶栽培品種葉片在不同低溫脅迫下各抗寒指標(biāo)的變化情況Fig. 1 Changes of cold resistance indexes of Camellia oleifera cultivars in Henan

表2 低溫脅迫下不同油茶品種各抗寒指標(biāo)的隸屬函數(shù)值Table 2 Subordinate function values of cold resistance indexes of different Camellia oleifera varieties under low temperature stress

3 結(jié)論與討論

我國幅員遼闊，以秦嶺淮河為分界的南北氣候差異顯著，所以為了使南種北移和對抗極端低溫天氣，非常有必要進(jìn)行植物抗寒性的研究。我國相關(guān)研究大多集中在糧食作物、蔬菜、果樹的抗寒研究方面，研究內(nèi)容包括形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化、分子機(jī)制等，取得了豐碩的成果。大量研究結(jié)果表明，低溫會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞膜脂過氧化，使其膜透性發(fā)生變化，電解質(zhì)外滲，引起相對電導(dǎo)率的改變，并產(chǎn)生大量MDA。電導(dǎo)率越高、MDA含量越高則表明低溫對細(xì)胞膜的傷害越大[18]。本研究結(jié)果表明，不同油茶品種葉片的相對電導(dǎo)率和MDA 含量均隨脅迫溫度的降低而上升。其中，‘長林4號’的測定值最大，‘大別山1號’ 的測定值最小，說明前者抗寒性最差，后者抗寒性最強(qiáng)。目前，有關(guān)長林系列油茶品種的研究報(bào)道較多，本研究結(jié)果和竇坦祥[7]的研究結(jié)果一致，雖然所選的長林品種不完全相同，但從中都可看出‘長林4號’的抗寒性較差。然而，文中測出的電導(dǎo)率、脯氨酸值均偏小于竇坦祥的測定值，這可能因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)用的材料為10年左右的油茶樹葉片，而竇坦祥使用的材料為2年生的嫁接苗，且測定時(shí)間為1月底，油茶樹經(jīng)過了當(dāng)年的低溫鍛煉。

在低溫脅迫下，大部分植物均會(huì)積累大量的脯氨酸，以適應(yīng)逆境條件下植物細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的變化[19]。脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，對植物無毒害作用，可參與諸多重要生理過程和物質(zhì)的合成，一般抗寒性越強(qiáng)的植物在低溫脅迫時(shí)其游離脯氨酸含量越高[20]?？扇苄缘鞍踪|(zhì)是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在多種植物上，蛋白質(zhì)的增加對抗寒性的提高有重要作用[21]。何偉[22]、于慶帆[23]對葡萄和杏的研究結(jié)果表明，植物在低溫鍛煉期間，細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白含量與抗凍性呈明顯的正相關(guān)，即可溶性蛋白含量隨低溫鍛煉抗凍性的提高而增加。本研究結(jié)果印證了以上觀點(diǎn)，其中抗寒性強(qiáng)的‘大別山1號’‘豫油茶1號’在低溫脅迫時(shí)其游離脯氨酸和可溶性蛋白含量均顯著高于其他品種。由于‘大別山1號’選育較晚，所以對其研究報(bào)道較少，本研究測定的該品種的游離脯氨酸含量和文佳等人[9]研究的結(jié)果一致。

近年來，以Logistic方程計(jì)算半致死溫度與生理生化指標(biāo)的隸屬函數(shù)評價(jià)相結(jié)合的方法因能更加客觀地評價(jià)植物的抗寒性而被人們接受[24]，但在油茶抗寒性的研究中能得以應(yīng)用的還不多。本研究結(jié)果表明，‘長林4號’‘長林40號’‘長林27號’‘XL210’‘大別山1號’‘豫油茶1號’的低溫半致死溫度分別為-6.31、-8.30、-7.51、-8.34、-9.92、-8.72 ℃，其半致死溫度和抗寒生理指標(biāo)測定結(jié)果一致。植物的抗寒性不僅與其原生長地點(diǎn)的環(huán)境條件有關(guān)，同時(shí)受栽培技術(shù)的影響。本研究結(jié)果表明，‘大別山1號’的抗寒性最強(qiáng)，‘豫油茶1號’的抗寒性次之，這與此2個(gè)油茶品種選育地的環(huán)境有關(guān)，2個(gè)品種均選自于油茶的生長北限河南省和安徽省，而來源于中國亞熱帶湖南省和江西省的長林品種和湘林品種的抗寒性均較弱。這個(gè)結(jié)論在早實(shí)核桃上已經(jīng)得到印證[25]，陳家銘[12]對同一山上不同生態(tài)區(qū)域的野生油茶品種的抗寒性進(jìn)行了比較，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，海拔越高溫度越低的野生油茶品種其抗寒性越強(qiáng)。之所以選自安徽省北部的‘大別山1號’的抗寒能力比選自于河南省南部的‘豫油茶1號’的更強(qiáng)，可能因?yàn)?，‘豫油?號’選自于早年從南方油茶移栽到河南的油茶品種，而并非是本地原產(chǎn)油茶品種。同時(shí)，長林系列品種的抗寒性也存在差異，這是因?yàn)榉N間存在差異，后續(xù)研究應(yīng)從分子方面進(jìn)一步探索油茶抗寒機(jī)理。由于大別山系列和豫油茶系列品種選育時(shí)間晚，推廣應(yīng)用范圍多集中在豫皖交界地帶，所以前人的研究未曾將長林系列、大別山系列、豫油茶系列品種放在一起進(jìn)行研究，本研究結(jié)果填補(bǔ)了這一空白，為河南省油茶品種引進(jìn)及栽培區(qū)域規(guī)劃提供了理論基礎(chǔ)。由于河南省主要油茶栽培品種數(shù)量相較于我國其他油茶主要栽培省區(qū)（如湖南省、江西省、廣西壯族自治區(qū)等）來說偏少，所以本研究結(jié)果對于某油茶品種系列而言其代表性還不夠強(qiáng)，而且所測數(shù)據(jù)是1年的研究結(jié)果，后續(xù)研究若要從某一品系中選擇適合河南省發(fā)展的油茶品種還需要擴(kuò)大研究范圍，也需要多年的重復(fù)數(shù)據(jù)以得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果。此外，油茶主要是花期容易受到低溫的影響，雖然抗寒方面的研究多是從葉片的脅迫著手，對油茶而言，可以嘗試對其花期的抗寒性，比如花結(jié)構(gòu)的抗寒生理、花粉活力和柱頭的可授性等方面進(jìn)行探究。