張立冬，李 輝，李 娟

(1.重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科 405400；重慶市開州區(qū)婦幼保健院：2.醫(yī)務(wù)科；3.超聲科 405400)

膀胱癌為泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在歐美國家發(fā)病率居男性惡性腫瘤的第4位，而且近年來有發(fā)病率增加和年輕化的趨勢[1]。較為明確的兩大致病危險(xiǎn)因素是吸煙和長期接觸工業(yè)化學(xué)產(chǎn)品，均與患者基因?qū)用娴母淖冇嘘P(guān)，其表觀和遺傳改變都參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2]。全基因組表達(dá)芯片分析和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)測定都提示一系列的信號通路在膀胱癌中存在異常的激活，這些通路與細(xì)胞分化、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，以及血管生成有關(guān)，而這些通路在不同的膀胱中也存在著異質(zhì)性[3]。膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的慢性化的過程[4]。深入了解膀胱癌的發(fā)生機(jī)制，將為膀胱癌的預(yù)防和治療提供新的思路。長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)是腫瘤研究領(lǐng)域的一個(gè)新的成員，現(xiàn)在研究表明其在腫瘤的發(fā)生和腫瘤的抑制通路中有潛在的重要作用。研究顯示lncRNA ROR(以下簡稱ROR)和lncRNA ATB(以下簡稱ATB)在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中均具有重要作用[5-6]。因此，本文為進(jìn)一步探討ROR和ATB在膀胱癌患者中的表達(dá)情況和臨床意義，采用RT-PCR檢測膀胱癌患者癌組織和癌旁組織、膀胱癌患者血清和健康人血清中ROR和ATB表達(dá)水平，分析ROR和ATB表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系、兩者表達(dá)的相關(guān)性以及其表達(dá)對患者預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取在重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科住院的60例膀胱癌患者和同期60例健康者為研究對象，取腫瘤組織和癌旁組織(距離腫瘤邊緣至少5 cm的正常膀胱組織)，分別抽取患者術(shù)前膀胱癌患者血清和健康者血清。60例膀胱癌患者年齡36～77歲，平均(58.2±7.5)歲；男45例，女15例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期37例，Ⅲ～Ⅳ期23例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例。健康者年齡35～75歲，平均(57.8±8.1)歲；男42例，女18例。兩組研究對象年齡、性別構(gòu)成等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法 根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中ROR和ATB的基因序列，通過Primer Express 2.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物，引物均由大連寶生物工程公司合成。取患者相應(yīng)組織標(biāo)本用肝素抗凝后，分離并計(jì)數(shù)(5～10)×106細(xì)胞與Trizol總RNA提取液1 mL混勻，凍存于-20 ℃環(huán)境中。采用Trizol法進(jìn)一步提取細(xì)胞的總RNA。產(chǎn)物用20 μL的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解。RNA完整度檢測用電泳法，RNA水平和純度的計(jì)算則用紫外分光光度計(jì)測量。提取1 μL的總RNA來構(gòu)成10 μL反應(yīng)體系，并參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書以進(jìn)行cDNA合成。將cDNA用于進(jìn)一步常規(guī)PCR擴(kuò)增。條件：94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃，30 s；58 ℃，30 s；71 ℃，40 s；共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。以U6為內(nèi)參照。

1.3觀察指標(biāo) 檢測膀胱癌患者癌組織、癌旁組織、血清和健康者血清中ROR和ATB表達(dá)情況；分析ROR和ATB在膀胱癌患者中組織與血清中表達(dá)的相關(guān)性，進(jìn)一步分析膀胱癌患者臨床病理特征年齡、腫瘤大小、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期與其癌組織和血清中ROR和ATB表達(dá)水平的關(guān)系；分析ROR和ATB兩者表達(dá)的相關(guān)性以及其表達(dá)對患者預(yù)后的影響。

2 結(jié) 果

2.1ROR和ATB在膀胱癌組織和血清中的表達(dá) ROR在膀胱癌組織中的相對表達(dá)量(1.42±0.15)明顯高于癌旁組織(0.68±0.08)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ATB在膀胱癌組織中的相對表達(dá)量(1.52±0.16)明顯高于癌旁組織(0.81±0.09)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ROR在膀胱癌患者血清中的相對表達(dá)量(1.09±0.10)明顯高于健康人血清(0.63±0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ATB在膀胱癌患者血清中的相對表達(dá)量(1.32±0.12)明顯高于健康人血清(0.71±0.07)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2ROR和ATB在膀胱癌患者中組織與血清中表達(dá)的相關(guān)性 膀胱癌患者組織中ROR和ATB的表達(dá)與血清中的ROR和ATB的表達(dá)間呈正相關(guān)(r=0.472、0.299，P<0.05)。

2.3ROR在膀胱癌患者中的表達(dá)與其臨床特征的關(guān)系 結(jié)果顯示，ROR在膀胱癌患者組織和血清表達(dá)水平與患者腫瘤大小、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡和性別無關(guān)(P>0.05)。見表1。

2.4ATB在膀胱癌患者中的表達(dá)與其臨床特征的關(guān)系 結(jié)果顯示，ATB在膀胱癌患者組織和血清表達(dá)水平與患者腫瘤大小、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡和性別無關(guān)(P>0.05)。見表2。

2.5膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與臨床病理特征的關(guān)系 在膀胱癌患者中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與年齡和性別無關(guān)(P>0.05)；與腫瘤大小、病理分級、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、ROR高表達(dá)和ATB高表達(dá)有關(guān)(P<0.05)。見表3。

2.6膀胱癌ROR和ATB在膀胱癌組織中的表達(dá)與生存預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier分析顯示，ROR和ATB高表達(dá)3年生存率(68.33%和58.33%)明顯低于ROR和ATB低表達(dá)組(86.67%和88.33%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 ROR在膀胱癌患者中的表達(dá)與其臨床特征的關(guān)系

表2 ATB在膀胱癌患者中的表達(dá)與其臨床特征的關(guān)系

表3 膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與臨床病理特征的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

現(xiàn)代生物學(xué)研究表明人類基因組編碼蛋白的基因大約只有20 000個(gè)，僅占人類基因組序列的2%，但是通過芯片技術(shù)，以及全基因組和轉(zhuǎn)錄組的測序表明，基因組中至少90%是被轉(zhuǎn)錄的[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，人類轉(zhuǎn)錄組遠(yuǎn)比蛋白編碼基因以及它們的剪切變體復(fù)雜，而顯示出有大量的反義、重疊的非編碼RNA的表達(dá)。盡管起初懷疑這些表達(dá)是轉(zhuǎn)錄組的噪聲，而最新的證據(jù)表明這些基因組中的黑箱可能在細(xì)胞中的發(fā)育和代謝中發(fā)揮重要的作用[8-9]。lncRNA現(xiàn)在已經(jīng)顯示其具有一系列的生物學(xué)功能，其中的一些功能包括基因組的印記、轉(zhuǎn)錄組的調(diào)控，這些功能的破壞或失調(diào)在腫瘤的發(fā)生中起了關(guān)鍵的作用。

lncRNA具有能夠識別互補(bǔ)序列，而這一特定的作用，在RNA的轉(zhuǎn)錄后加工過程中有重要的意義，這些轉(zhuǎn)錄后加工的過程包括剪切、編輯、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯以及降解[10-11]。哺乳動物大多數(shù)的基因都表達(dá)其反義轉(zhuǎn)錄物，而這些轉(zhuǎn)錄物構(gòu)成的一類lncRNA在調(diào)控RNA的動力學(xué)方面具有較大的優(yōu)勢。新近研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌中l(wèi)ncRNA-HULC可以作為一種分子誘餌，或者可以稱為miRNA sponge,而其能夠調(diào)控隱退miR-372的表達(dá)，而影響了其靶蛋白RPKACB的表達(dá)[12]。膀胱癌中的另一研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子-β可以促進(jìn)肝細(xì)胞中ATB的表達(dá)，而實(shí)驗(yàn)證實(shí)ATB可以發(fā)揮microRNA sponge的功能，能夠特異性的結(jié)合miR-200家族，從而抑制了miR-200作為抑癌microRNA的功能，顯著提高了miR-200靶基因CDK9/2的表達(dá)而促進(jìn)了膀胱癌的轉(zhuǎn)移[13]。在三陰性乳腺癌中研究發(fā)現(xiàn)，ROR也可以特異性的靶向抑制miR-145，而提高了miR-145負(fù)向調(diào)控的靶基因ARF6的表達(dá)，而最終促進(jìn)了三陰性乳腺癌中細(xì)胞的侵襲[14]。目前，關(guān)于ROR和ATB在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展作用的研究較少。

在本研究中，采用RT-PCR對膀胱癌患者癌組織和癌旁組織、膀胱癌患者血清和健康者血清中ROR和ATB表達(dá)水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)ROR和ATB在膀胱癌患者癌組織和血清中呈高表達(dá)，均明顯高于癌旁組織和健康者血清中的表達(dá)(P<0.05)，也有研究顯示ROR和ATB在肺癌、膀胱癌、甲狀腺瘤、多發(fā)性骨髓瘤、膀胱癌、胃癌等多種腫瘤中呈異常表達(dá)[15-16]。采用Pearson相關(guān)性分析顯示膀胱癌患者組織中ROR和ATB的表達(dá)與血清中的ROR和ATB的表達(dá)間均呈明顯的正相關(guān)(P<0.05)，這進(jìn)一步說明ROR和ATB在膀胱癌中呈高表達(dá)，也為ROR和ATB在膀胱癌患者血液檢測成為可能。進(jìn)一步分析ROR和ATB表達(dá)水平與膀胱癌患者臨床預(yù)后等相關(guān)因素間的關(guān)系，結(jié)果顯示，ROR和ATB在膀胱癌患者組織和血清表達(dá)水平與患者腫瘤大小、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡和性別無關(guān)(P>0.05)。多因素Logistic回歸分析顯示，腫瘤大小、病理分級、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、ROR高表達(dá)和ATB高表達(dá)是膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這進(jìn)一步表明高表達(dá)ROR和ATB的膀胱癌侵襲性強(qiáng)和病情易進(jìn)展。

分析ROR和ATB和膀胱癌患者的預(yù)后關(guān)系中，研究結(jié)果顯示ROR和ATB高表達(dá)3年生存率明顯低于ROR和ATB低表達(dá)組。這提示ROR和ATB也是影響膀胱癌患者預(yù)后的重要分子。然而，關(guān)于ROR和ATB在膀胱癌發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制還了解甚少，其在膀胱癌中的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[17]。

在本研究中ROR和ATB在膀胱癌患者組織和血清中呈高表達(dá)，可能和ROR和ATB隨著腫瘤的進(jìn)展而擴(kuò)增有關(guān)，同時(shí)ROR和ATB在膀胱癌患者組織和血清表達(dá)水平與患者腫瘤大小、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)。由此可以推斷ROR和ATB在膀胱癌中與患者臨床預(yù)后密切相關(guān)，同時(shí)預(yù)后分析也顯示，高表達(dá)的ROR和ATB患者3年生存率降低，這是其可能成為膀胱癌預(yù)后不良的重要分子標(biāo)記物，為進(jìn)一步指導(dǎo)膀胱癌的治療和預(yù)后等提供了理論依據(jù)。