王喜歡， 張金華， 胡亞南， 張 洪

(南陽市第二人民醫(yī)院心血管內(nèi)科， 河南 南陽 473000)

血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells,VECs)是被覆于血管內(nèi)膜的一群細(xì)胞，代謝活躍且可合成及分泌大量的血管活性物質(zhì)，對(duì)維持血管正常生理功能具有重要作用[1]。研究顯示，在糖尿病血管并發(fā)癥中均涉及到血管內(nèi)皮的損傷及功能障礙，且這種損傷可進(jìn)一步誘發(fā)和加重其它急性心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。眾多研究發(fā)現(xiàn)，急、慢性的高糖狀態(tài)可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，并誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，繼發(fā)血管內(nèi)皮損傷[4]。但是，關(guān)于高糖誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制還不甚明了，多數(shù)研究認(rèn)為，活性氧生成增加所致的氧化損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)是關(guān)鍵的因素之一[5]。故而維持內(nèi)皮細(xì)胞中氧化還原反應(yīng)平衡對(duì)于保護(hù)血管內(nèi)皮具有重要的意義。紫草素(shikonin)是從紫草的根中提取的一種脂溶性萘醌類化合物，其藥理學(xué)作用研究表明，紫草素具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和抗腫瘤等作用，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景[6-8]。本研究以大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，評(píng)估紫草素對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，并從氧化應(yīng)激的角度初步探討其可能的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM培養(yǎng)基購自HyClone；紫草素購自Enzo Biochem，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1A所示；大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室自行凍存；抗cleaved caspase-3/caspase-3和β-actin抗體購自Cell Signaling Technololgy；抗Nrf2 (nuclear)、 Nrf2 (total)、 H3及HO-1抗體購自Santa Cruz； CCK-8細(xì)胞活力分析試劑盒購自廣州奕源公司；細(xì)胞核蛋白分離試劑盒、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)檢測(cè)試劑盒及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所； 丙二醛(malondialdehyole, MDA)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)、分組和干預(yù) VECs用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、1%青霉素、1%鏈霉素及10 μg/L β-ECGF的DMEM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，定期換液及傳代，保證細(xì)胞良好的生存狀態(tài)。將消化后的細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁生長至約80%融合時(shí)，更換培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞做12 h的饑餓處理，而后加藥干預(yù)。細(xì)胞組別設(shè)置為：正常對(duì)照組(control組，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為5.5 mmol/L)、高糖組(Gh組，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為33 mmol/L)、高糖+低濃度紫草素組(GSl組，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為33 mmol/L，紫草素濃度為0.1 μmol/L)、高糖+中濃度紫草素組(GSm組，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為33 mmol/L，紫草素濃度為1 μmol/L)和高糖+高濃度紫草素組(GSh組，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為33 mmol/L，紫草素濃度為10 μmol/L)。

2.2CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力 將消化后的細(xì)胞按照每孔5×103個(gè)的密度接種至96孔板，經(jīng)相應(yīng)的藥物干預(yù)后，在超凈臺(tái)中向每孔加入CCK-8試劑10 μL，重新放回CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。取出培養(yǎng)板用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm波長處的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)活力。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔取其均值，同時(shí)設(shè)只加入培養(yǎng)基的單孔作為空白對(duì)照。

2.3檢測(cè)MDA和ROS的含量及SOD和GSH-Px活性的變化以評(píng)價(jià)細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài) 各項(xiàng)檢測(cè)均依據(jù)公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)干預(yù)后的凋亡狀況。各組細(xì)胞消化后，用PBS漂洗2次，然后離心收集細(xì)胞，依據(jù)說明書要求加入Binding Buffer，而后室溫條件下加入Annexin V-FITC避光孵育10 min，最后避光條件下加入PI孵育5 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組的熒光強(qiáng)度并進(jìn)行定量分析；檢測(cè)條件為 Ex=488 nm， Em=530 nm。

2.5Western blot 檢測(cè)蛋白水平 對(duì)于細(xì)胞核蛋白核Nrf2的測(cè)定，首先根據(jù)細(xì)胞核蛋白分離試劑盒說明書提取核蛋白；總蛋白的檢測(cè)直接進(jìn)行RIPA裂解液收集細(xì)胞蛋白。對(duì)所提蛋白(包含分離的核蛋白和全蛋白)進(jìn)行定量，然后依據(jù)定量結(jié)果調(diào)整蛋白上樣量(60 μg)后進(jìn)行SDS-PAGE。待電泳結(jié)束，通過電轉(zhuǎn)的方法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。取出PVDF膜置于小盒子中，并在室溫條件下加入5%的脫脂牛奶封閉90 min，棄牛奶后按說明書要求的比例加入相應(yīng)的 I 抗4 ℃孵育過夜，次日取出PVDF膜經(jīng)TBST洗滌3次，每次5 min；然后按說明書要求加入相對(duì)應(yīng)的 II 抗室溫孵育2 h，經(jīng)TBST洗滌3次后于暗室中撒ECL發(fā)光液顯影，曝光并沖洗膠片。全蛋白以β-actin為內(nèi)參照，核蛋白以H3為內(nèi)參照。所得結(jié)果采用ImageJ進(jìn)行灰度半定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)錄入SPSS 15.0軟件中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間的比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 紫草素對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用

CCK-8法細(xì)胞活力檢測(cè)的結(jié)果顯示，高濃度的葡萄糖可致使內(nèi)皮細(xì)胞活力降低，而同時(shí)給予不同濃度的紫草素(結(jié)構(gòu)式見圖1A)干預(yù)后，細(xì)胞活力有所回升，且紫草素濃度在1 μmol/L及10 μmol/L時(shí)的作用顯著，見圖1B。流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)的結(jié)果顯示，高濃度葡萄糖處理內(nèi)皮細(xì)胞后，細(xì)胞的早期凋亡率顯著上升(P<0.05)；而加入1 μmol/L及10 μmol/L的紫草素干預(yù)后，細(xì)胞早期凋亡率分別降低(P<0.05)，見圖2A。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，高濃度葡萄糖處理內(nèi)皮細(xì)胞后，caspase-3發(fā)生剪切，而加入1 μmol/L和10 μmol/L的紫草素干預(yù)后，cleaved caspase-3明顯減少(P<0.05)，見圖2B。以上結(jié)果提示紫草素可抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

2 紫草素對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

如圖3所示，Gh組的內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)高糖誘導(dǎo)后， MDA及ROS的含量顯著增加，同時(shí)胞內(nèi)SOD及GSH-Px的活性顯著降低(P<0.05)；而GSm組和GSh組的細(xì)胞分別經(jīng)1 μmol/L及10 μmol/L紫草素干預(yù)之后，MDA及ROS的含量相比于Gh組顯著降低， SOD及GSH-Px的活性相比于Gh組則顯著增加(P<0.05)。這些結(jié)果說明高糖可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，而紫草素可部分抑制該作用。

3 紫草素對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中Nrf2/HO-1信號(hào)通路活性的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，Gh組的內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)高糖誘導(dǎo)后，HO-1及核內(nèi)Nrf2的蛋白水平增加，總Nrf2的蛋白表達(dá)未出現(xiàn)明顯變化；而GSh組的細(xì)胞經(jīng)10 μmol/L紫草素干預(yù)之后，HO-1和核內(nèi)Nrf2的蛋白水平相比于Gh組顯著降低，總Nrf2蛋白的水平?jīng)]明顯變化。這一結(jié)果說明紫草素可抑制內(nèi)皮細(xì)胞中抗氧化信號(hào)通路Nrf2/HO-1的激活，進(jìn)而促進(jìn)凋亡效應(yīng)蛋白caspase-3的活化，維持胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)的穩(wěn)定。

Figure 1. The effect of shikonin on the viability of VECs induced by high glucose. A: the structural formula of shikonin; B: the cell viability detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsGhgroup.

圖1紫草素對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

討 論

紫草素是一種中草藥提取物，具有抗氧化應(yīng)激和抗炎等廣泛的藥理活性。本研究以高糖刺激大鼠來源胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，而后在此基礎(chǔ)上研究紫草素對(duì)內(nèi)皮損傷的作用。結(jié)果顯示高糖刺激可顯著降低內(nèi)皮細(xì)胞活力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而經(jīng)紫草素干預(yù)后細(xì)胞凋亡率有所降低。結(jié)果提示紫草素可抑制高糖所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，具有一定保護(hù)血管內(nèi)皮的活性。

然后我們進(jìn)一步研究了紫草素抑制高糖所致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中可能涉及的作用機(jī)制。正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)存在多種抗氧化物質(zhì)，可及時(shí)清除細(xì)胞代謝過程中生成的各種活性氧，維持氧化還原反應(yīng)的平衡[9]。一旦胞內(nèi)氧化產(chǎn)物如MDA及ROS聚集過多，超出了抗氧化系統(tǒng)(如SOD及GSH-Px)的調(diào)節(jié)范圍，即會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，并進(jìn)一步通過復(fù)雜的信號(hào)通路致使細(xì)胞凋亡[10-11]。早期的研究提示，高濃度的葡萄糖可刺激細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成[12]。故而本研究檢測(cè)了內(nèi)皮細(xì)胞中的氧化應(yīng)激狀態(tài)，結(jié)果顯示經(jīng)高糖誘導(dǎo)后，內(nèi)皮細(xì)胞中MDA及ROS的含量顯著增加，同時(shí)胞內(nèi)SOD及GSH-Px的活性顯著降低；加入紫草素干預(yù)則可下調(diào)胞內(nèi)MDA及ROS的含量，同時(shí)升高 SOD及GSH-Px的活性。結(jié)果表明高糖可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中ROS的聚集及氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，而紫草素可部分抑制該作用；這可能是紫草素在高糖環(huán)境下保護(hù)血管內(nèi)皮的機(jī)制之一。

Figure 2. The effect of shikonin on the apoptosis of VECs induced by high glucose. A: the representative images of Annexin V/PI double staining by flow cytometry and statistical analysis of cell apoptosis; B: the representative images of Western blot and statistical analysis of cleaved caspase-3 protein levels. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsGhgroup.

圖2紫草素對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及凋亡蛋白的影響

細(xì)胞內(nèi)還存在應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的防御機(jī)制， Nrf2就是其中之一。在氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，Nrf2活化后進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合抗氧化原件，促進(jìn)各種抗氧化酶及解毒酶的合成，去除過量的ROS，以抵抗氧化應(yīng)激損傷[13-15]。HO-1即是Nrf2下游的一種血紅素降解限速酶，具有較強(qiáng)的自由基清除作用，可對(duì)抗氧化損傷[15-17]。故而本研究進(jìn)一步檢測(cè)了在高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中，Nrf2信號(hào)通路的狀態(tài)以及紫草素的作用。結(jié)果顯示，經(jīng)高糖誘導(dǎo)后內(nèi)皮細(xì)胞中HO-1及核內(nèi)Nrf2的蛋白表達(dá)增加，總Nrf2的蛋白表達(dá)未出現(xiàn)明顯變化；可能是高糖刺激活性氧的生成激活了細(xì)胞內(nèi)的自我保護(hù)機(jī)制，通過促進(jìn)胞內(nèi)Nrf2的核轉(zhuǎn)位以及下游HO-1的表達(dá)來降低氧化應(yīng)激所致的損傷。而內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)10 μmol/L紫草素干預(yù)后，HO-1和核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著降低。這提示紫草素可降低核內(nèi)Nrf2的表達(dá)，其減輕高糖所致的氧化損傷的作用可能與Nrf2/HO-1信號(hào)通路密切相關(guān)。

Figure 3. The effect of shikonin on the status of oxidative stress in VECs induced by high glucose. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsGhgroup.

圖3Shikonin對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

Figure 4. The effect of shikonin on the activation of Nrf2/HO-1 pathway in VECs induced by high glucose. A: the representative images of Western blot and statistical analysis of nuclear (N) and total (T) Nrf2 expression; B: the representative images of Western blot and statistical analysis of HO-1 expression. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsGhgroup.

圖4Shikonin對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞Nrf2/HO-1信號(hào)通路活性的影響

綜上所述，紫草素可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并通過下調(diào)核Nrf2轉(zhuǎn)位和 HO-1的表達(dá)，以抵抗高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。