張 玲， 宋 杰， 孫燕玲， 鄭永江， 林東軍， 方志剛

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院血液科， 廣東 廣州 510630)

研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖(Astragaluspolysaccharides，APS)對于2型糖尿病動物模型具有增加胰島素敏感性、改善糖耐量、降低血糖和血脂、減少肝臟脂肪沉積以及減輕體重等作用[1-3]；APS還具有降低脂毒性和改善骨骼肌游離脂肪酸代謝的作用[4-5]。另有研究表明，APS具有改善慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)的功效[6]。近期我們發(fā)現(xiàn)APS改善CHF的機(jī)制可能是，APS活化CHF時心肌被抑制的腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)活性，從而促進(jìn)心肌對游離脂肪酸攝取利用，改善心肌代謝底物結(jié)構(gòu)，進(jìn)而減輕CHF[7]。有研究證實(shí)高同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是引起心血管疾病的獨(dú)立危險因素，高Hcy主要通過損傷血管內(nèi)皮而引起心血管疾病[8]。我們近期研究表明，APS可以改善游離脂肪酸誘導(dǎo)的損傷，其機(jī)制與AMPK-內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)信號通路有關(guān)[9]，而APS對高Hcy引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響尚未見報道。本實(shí)驗擬采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)復(fù)制高Hcy的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，觀察APS對高Hcy引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響，探討其可能的保護(hù)機(jī)制及其相應(yīng)的信號通路。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和儀器

HUVECs購自ATCC。優(yōu)化水煎工藝從膜莢黃芪(上海藥材公司)中提取APS(80 kD～120 kD，湖北中醫(yī)學(xué)院藥用植物鑒定教研室鑒定)[10]。Hcy購自Sigma；總RNA提取試劑Trizol Reagent購自Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas；PCR熒光定量檢測試劑盒購自Genecopoeia；引物由Invitrogen合成；抗p-AMPKα單克隆抗體和抗AMPKα單克隆抗體均購自Cell Sigaling Technology；鼠抗β-actin單克隆抗體購自Santa Cruz；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒和超氧化酶歧化酶(superoxidase dismutase，SOD)測定試劑盒均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。Prism 7500 real-time PCR儀購自ABI；ImageQuant LAS 4000化學(xué)發(fā)光儀購自GE；垂直板蛋白電泳裝置購自Bio-Rad。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HUVECs采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%的CO2孵育箱中培養(yǎng)。細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后，換無血清DMEM培養(yǎng)基。實(shí)驗分4組：正常對照(control,Ctrl)組、APS組[APS(200 mg/L)[4-5]處理24 h[11]]、Hcy組[Hcy(1 mmol/L)[12]處理24 h]和Hcy+APS組[Hcy(1 mmol/L)和APS(200 mg/L)共同處理24 h]。

2.2MTT實(shí)驗 取生長良好的細(xì)胞，以濃度2.0×107/L的細(xì)胞懸液接種96孔培養(yǎng)板中，每個實(shí)驗組種8孔，每孔接種100 μL，培養(yǎng)12 h細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，按實(shí)驗分組加入相應(yīng)培養(yǎng)液100 μL繼續(xù)培養(yǎng)。在24 h時相點(diǎn)的前4 h各取培養(yǎng)板一塊，每孔加入濃度為 5 g/L MTT 50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄上清液后向每孔加入20% DMSO 100 μL，振蕩后在酶標(biāo)儀上以490 nm波長測吸光度A值。

2.3LDH和SOD活性及MDA含量的檢測 HUVECs進(jìn)行同步化后，分為對照組、Hcy組、APS組和Hcy+APS組。干預(yù)24 h后，分別提取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，使用LDH、SOD和MDA測定試劑盒進(jìn)行檢測。

2.4RT-qPCR檢測SOD1和過氧化氫酶(catalase,CAT)及NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2, NOX2)的mRNA表達(dá) 取生長良好的HUVECs。按照Trizol Reagent說明書進(jìn)行裂解，提取細(xì)胞總RNA，分光光度法測定并計算提取的總RNA含量與濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將內(nèi)皮細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，SOD1、CAT及NOX2 mRNA及內(nèi)參照β-actin引物序列見表1[10]，退火溫度均為60 ℃，PCR反應(yīng)循環(huán)次數(shù)為40次。按定量PCR試劑盒進(jìn)行操作：以20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR，取2 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物與CAT、SOD1、NOX2的mRNA及內(nèi)參照β-actin引物進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 32 s，40個循環(huán)。在ABI Prism 7500 real-time PCR System上操作反應(yīng)，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法表示。

2.5Western blot檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞中AMPKα和p-AMPKα蛋白的表達(dá)水平 將處理后的各組細(xì)胞用PBS沖洗，冰上充分裂解后，置4 ℃超速離心機(jī)，離心，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒定量。煮沸5 min, SDS-PAGE分離蛋白后，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，封閉、漂洗后加入Ⅰ抗于4 ℃孵育過夜，漂洗后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔Ⅱ抗(1∶800稀釋)室溫孵育1 h，漂洗后ECL顯色，用高清晰度彩色病理細(xì)胞測量程序的圖形分析軟件系統(tǒng)測出相對吸光度值。

表1 RT-qPCR引物序列

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 黃芪多糖對Hcy刺激后HUVECs活力的影響

HUVECs在不同濃度Hcy(0.25、0.5、1及2 mmol/L)作用24 h后，細(xì)胞活力降低，且隨著Hcy濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸下降(P<0.05);HUVECs在不同濃度黃芪多糖(50、100、200和400 mg/L)作用24 h后，細(xì)胞活力的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；細(xì)胞按照對照組、Hcy組(1 mmol/L Hcy)、APS組(200 mg/L黃芪多糖)和Hcy+APS組(1 mmol/L Hcy+200 mg/L APS)處理24 h后，與Hcy組相比,Hcy+APS組的細(xì)胞活力顯著增加(P<0.05)，但仍未恢復(fù)到對照組水平(P<0.05)，說明APS能夠減輕Hcy引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞活力的下降，見圖1。此外與對照組相比，APS組的細(xì)胞活力及LDH水平均無明顯變化，表明APS對HUVECs細(xì)胞活力無影響；而Hcy組的LDH活性較對照組相比明顯增加(P<0.05)，而Hcy+APS組LDH活性較Hcy組顯著降低(P<0.05)，表明APS能減輕Hcy導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，見圖2。

Figure 1. The effects of APS and Hcy on the Cell viability of HUVECs. Mean±SD.n=6.▲P<0.05vsCtrl group;*P<0.05vsHcy group.

圖1APS及Hcy對人血管內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

Figure 2. The effects of APS and Hcy on LDH activity in HUVECs. Mean±SD.n=6.▲P<0.05vsCtrl group;*P<0.05vsHcy group.

圖2APS和Hcy對人血管內(nèi)皮細(xì)胞LDH活性的影響

2 黃芪多糖對HUVECs中MDA含量和SOD活性的影響

為進(jìn)一步明確APS及Hcy對HUVECs的作用是否與氧化應(yīng)激有關(guān)，我們檢測了氧化應(yīng)激的相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果顯示，APS組的MDA含量與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性,Hcy組的MDA含量與對照組相比明顯增加(P<0.05)，而Hcy+APS組的MDA含量與Hcy組相比顯著降低(P<0.05); APS組的SOD活性與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，而Hcy組的SOD活性與對照組相比明顯下降(P<0.05)，Hcy+APS組的SOD活性與Hcy組相比明顯增加(P<0.05),見圖3。這說明APS與Hcy對HUVECs的影響與氧化應(yīng)激有關(guān)。

Figure 3. The effects of APS and Hcy on MDA content and SOD activity in HUVECs. Mean±SD.n=6.▲P<0.05vsCtrl group;*P<0.05vsHcy group.

圖3APS及Hcy對人血管內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量及SOD活性的影響

3 黃芪多糖對HUVECs中SOD1、CAT和NOX2 mRNA表達(dá)的影響

我們采用RT-qPCR檢測了氧化應(yīng)激物質(zhì)相關(guān)酶在HUVECs的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組相比，APS組SOD1、CAT和NOX2的mRNA表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，而Hcy組SOD1和CAT的mRNA表達(dá)水平顯著降低，NOX2的mRNA的表達(dá)水平則顯著增加(P<0.05)；Hcy+APS組SOD1和CAT的mRNA表達(dá)水平較Hcy組明顯升高，而NOX2的mRNA表達(dá)水平則顯著下降(P<0.05),見圖4。這說明APS對正常細(xì)胞氧化及抗氧化應(yīng)激物質(zhì)的生成無明顯影響，但可以減少Hcy損傷細(xì)胞氧化應(yīng)激物質(zhì)的產(chǎn)生及增加抗氧化物質(zhì)的生成。

Figure 4. The effects of APS and Hcy on the mRNA expression of SOD1, CAT and NOX2 in HUVECs. Mean±SD.n=6.▲P<0.05vsCtrl group;*P<0.05vsHcy group.

圖4APS及Hcy對人血管內(nèi)皮細(xì)胞SOD1、CAT和NOX2mRNA表達(dá)的影響

4 黃芪多糖對HUVECs中p-AMPKα蛋白水平的影響

APS組和Hcy組的p-AMPKα蛋白水平分別與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性； Hcy+APS組p-AMPKα的蛋白水平與Hcy組相比明顯增加(P<0.05),見圖5。這表明APS可以活化Hcy損傷細(xì)胞的AMPK，而對正常細(xì)胞AMPK的活化無明顯影響。

5 Compound C逆轉(zhuǎn)黃芪多糖對HUVECs的保護(hù)作用

為進(jìn)一步確認(rèn)APS抗Hcy損傷是否通過活化AMPK通路及明確AMPK活化相關(guān)通路是否是唯一通路，我們加入AMPK抑制劑Compound C，將實(shí)驗分為正常對照(Ctrl)組、APS組[APS(200 mg/L)處理24 h]、Hcy組[Hcy(1 mmol/L)處理24 h]、Hcy+APS組[Hcy(1 mmol/L)和APS(200 mg/L)共同處理24 h]、Hcy+APS+Com組[Hcy(1 mmol/L)、APS(200 mg/L)及Compound C (10 μmol/L)處理24 h]和Com組[Compound C (10 μmol/L)處理24 h]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純Compound C刺激對細(xì)胞活力無明顯影響，而Hcy+APS+Com組細(xì)胞活力較Hcy+APS組明顯下降(P<0.05)，說明AMPK的激活參與APS對Hcy引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的拮抗作用，見圖6。APS對Hcy導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的拮抗作用未被AMPK阻斷劑Compound C完全阻斷，這說明AMPK通路只是APS發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制之一。

Figure 5. The effect of APS and Hcy on the protein levels of p-AMPKα and AMPKα in HUVECs. Mean±SD.n=6.▲P<0.05vsCtrl group;*P<0.05vsHcy group.

圖5APS及Hcy對人血管內(nèi)皮細(xì)胞p-AMPKα和AMPKα蛋白表達(dá)的影響

Figure 6. Compound C (Com), an AMPK inhibitor, weakened the protective effect of APS on HUVECs. Mean±SD.n=6.▲P<0.05vsctrl group;*P<0.05vsHcy group;△P<0.05vsHcy+APS group.

圖6AMPK阻斷劑CompoundC可減弱APS對人血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

討 論

Hcy是動脈粥樣硬化的獨(dú)立危險因子之一，而Hcy是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷從而引起動脈粥樣硬化的重要原因之一。Hcy導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損傷的機(jī)制包括死亡受體通路、氧化應(yīng)激通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路及線粒體通路[8]。正常細(xì)胞內(nèi)的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)主要包括羥自由基、氧自由基、超氧陰離子、過氧化氫和脂質(zhì)過氧化物等。ROS是生理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)重要的信號因子，它與細(xì)胞生長、黏附和轉(zhuǎn)錄因子的活化等都密切相關(guān)。通常情況下，由于細(xì)胞內(nèi)存在眾多酶參與的抗氧化體系，ROS對細(xì)胞不構(gòu)成傷害；病理狀態(tài)下，ROS產(chǎn)生過多或者是抗氧化酶出現(xiàn)異常時，過多的ROS將導(dǎo)致細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，甚至凋亡或壞死。在本研究中，Hcy 呈劑量依賴性抑制內(nèi)皮細(xì)胞活力，Hcy 組 SOD 活性下降，而LDH 活性和 MDA 含量升高，這說明氧化應(yīng)激參與了Hcy 對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，這與付勇南等[12]的研究一致。

先前研究發(fā)現(xiàn)，無論是對鏈脲菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病動物模型，還是遺傳性2型糖尿病模型(KKAy小鼠)或胰島素抵抗模型，APS都具有增加胰島素敏感性，改善糖耐量，降低血糖和血脂、減少肝臟脂肪沉積以及減輕體重等作用[1-3]。近期我們發(fā)現(xiàn)APS可以改善慢性心衰，可能機(jī)制是APS可活化慢性心衰時心肌被抑制的AMPK活性，從而促進(jìn)心肌對游離脂肪酸的攝取利用，改善心肌代謝底物結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改善心衰[7]。目前的研究表明，APS可以改善游離脂肪酸誘導(dǎo)的損傷，其機(jī)制與AMPK-eNOS信號通路有關(guān)[9]，然而，APS對高Hcy引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，APS不僅對血管內(nèi)皮細(xì)胞活力無損傷，而且可以改善Hcy引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞活力下降，鑒于APS的保護(hù)作用可能是通過激活 AMPK 通路實(shí)現(xiàn)[13]，本研究還通過 Western blot 檢測各組 p-AMPKα的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)Hcy+APS組p-AMPKα 的蛋白水平明顯高于Hcy 組，Hcy組與對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，說明Hcy和APS共同干預(yù)時，黃芪多糖能夠活化AMPK。加入AMPK抑制劑Compound C 則可以顯著降低APS減輕Hcy對內(nèi)皮細(xì)胞損傷的效應(yīng)，說明AMPK在APS抑制Hcy引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中起到重要作用。有研究表明AMPK激活后具有抑制細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的作用[14]，本研究還發(fā)現(xiàn)與Hcy組比較，Hcy+APS組相應(yīng)氧化應(yīng)激指標(biāo)(LDH及SOD活性和MDA 含量)的變化，以及對應(yīng)的mRNA 表達(dá)水平的改變，說明APS可能是通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激，使細(xì)胞內(nèi)的ROS水平下降，產(chǎn)生血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。因此推測 AMPK-eNOS通路在APS抑制 Hcy引起的細(xì)胞損傷中起到重要作用。

本研究是在細(xì)胞水平上觀察Hcy對HUVECs的細(xì)胞活力及氧化應(yīng)激的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)APS對Hcy損傷的內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與APS激活A(yù)MPK有關(guān)。我們先前研究證實(shí)APS可通過調(diào)節(jié)AMP/ATP比值而激活A(yù)MPK[5]，然而AMPK活化后是通過什么機(jī)制抑制細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激目前尚不清楚，有待我們進(jìn)一步探索。