劉位位，孫起翔，張景鴻，楊 霞，李超乾

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.呼吸內(nèi)科、2.急診科，廣西 南寧 530021；3.廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院呼吸科，廣西 南寧 530021)

全球哮喘防治創(chuàng)議指出，支氣管哮喘(哮喘)患者雖然在一些國家住院率和死亡率均有所下降，但是在許多國家患病率仍不斷上升，哮喘仍然影響著全球的健康問題。目前，治療支氣管哮喘主要藥物為糖皮質(zhì)激素[1]，但長期使用高劑量糖皮質(zhì)激素治療可能會影響身高、導(dǎo)致骨骼疏松[2]，易形成激素依賴性，造成激素抵抗型哮喘。因此，針對哮喘的發(fā)病機(jī)制，尋找更為有效且能長期安全治療哮喘的藥物成為目前的研究熱點。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，通過霧化吸入滅活草分枝桿菌治療哮喘小鼠，可以減輕其氣道炎癥、降低氣道高反應(yīng)性，其作用可能與Toll樣受體、調(diào)節(jié)Th1/Th2[3]和Th17/Treg[4]失衡有關(guān)，但其作用機(jī)制尚未完全明確，仍需進(jìn)一步研究。

CD4+T細(xì)胞根據(jù)不同的細(xì)胞因子和功能，可以分為Th1和Th2細(xì)胞，哮喘表現(xiàn)為Th2優(yōu)勢應(yīng)答。在誘導(dǎo)Th0細(xì)胞分化為Th1和Th2細(xì)胞時，轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3起著重要作用。本研究主要通過用卵清蛋白(ovalbumin，OVA)制備支氣管哮喘小鼠模型，用滅活草分枝桿菌進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步研究草分枝桿菌對T-bet、GATA-3表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 OVA、佛波酯(phorbol-myristate-actetate，PMA)、離子霉素(美國Sigma公司)；氫氧化鋁凝膠(美國Pierce公司)；草分枝桿菌F.U.36注射液(成都金星健康藥業(yè)有限公司)；小鼠IL-4、IFN-γ ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)；TRIzol總RNA提取液(Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green核酸染料、PCR引物設(shè)計合成(TaKaRa公司)；流式抗體APC-IFN-γ、PE-IL-4(美國eBioscience公司)；流式抗體Percp-CD4、莫能霉素、固定/破膜液(美國BD公司)。

1.1.2儀器 酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)，超聲霧化器WH-2000(廣東粵華醫(yī)療器械廠)，病理圖像分析系統(tǒng)(德國Leica公司)，Applied Biosystem 7500 RT-PCR儀(美國ABI公司)，NanoDrop 2000超微量分光光度計(美國Thermo Scientific公司)，5810R高速低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，F(xiàn)ACS CantoⅡ型流式儀(美國BD公司)，自制霧化吸入箱等。

1.2動物分組與模型建立24只SPF級健康♂Balb/c小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號：SCXK桂2014-0002。根據(jù)隨機(jī)分配原則，分為正常組、哮喘組、治療組，每組8只。模型組和治療組均于d 0、7、14，用25 μg OVA和1 mg 氫氧化鋁(混于0.2 mL PBS中)腹腔注射，于d 21開始激發(fā)，將小鼠置于自制霧化箱中，用2% OVA PBS 10 mL霧化吸入，每次約30 min，連續(xù)7 d，治療組于d 28用1 mL草分枝桿菌F.U.36注射液(溶于10 mL生理鹽水)霧化吸入，連續(xù)5 d，正常組腹腔注射、激發(fā)和治療均用等量生理鹽水代替，哮喘組治療用等量生理鹽水代替。小鼠在末次激發(fā)24 h內(nèi)處死，并取相關(guān)組織。用10%水合氯醛0.1 mL腹腔注射處死小鼠，符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3標(biāo)本采集用10%水合氯醛麻醉小鼠后，行氣管插管，用4℃ 0.5 mL PBS灌洗，緩慢注入肺中，回收支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，灌洗3次，回收率>85%，收集放入-80℃冰箱保存。打開胸腔，分離支氣管肺組織，灌洗4%多聚甲醛使肺組織膨脹，取出左肺組織，浸潤4%多聚甲醛固定，24 h后漂洗、乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片厚約4 μm，行HE和過碘酸-雪夫(periodic acid Schiff，PAS)染色。右下肺葉置于-80℃冰箱保存,用于real time-PCR檢測。余右肺用于流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.4肺部病理組織學(xué)檢查取左肺組織，固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片，行HE和 PAS染色，按照文獻(xiàn)方法，光鏡下觀察肺部炎癥情況。

1.5ELISA法檢測BALF中IL-4、IFN-γ水平嚴(yán)格按照說明書提供的方法操作，終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀檢測450 nm光密度值(OD值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ濃度。

1.6實時熒光定量PCR測定T-bet、GATA-3mRNA表達(dá)TRIzol試劑提取肺組織總RNA，檢測肺組織中總RNA濃度及A260/A280比值。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，放置于-20℃保存。用SYBR Green核酸染料進(jìn)行real time-PCR，將GAPDH作為內(nèi)參照。GAPDH：上游引物5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，下游引物5′-TGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′；T-bet：上游引物5′-GTTCAACCAGCACCAGACAGAG-3′，下游引物5′-TGGTCCACCAAGACCACATC-3′；GATA-3：上游引物5′-GGATGTAAGTCGAGGCCCAAG-3′，下游引物5′-ATTGCAAAGGTAGTGCCCGGTA-3′。反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)。各樣本均設(shè)3個復(fù)孔，基因表達(dá)的相對變化的倍數(shù)用2-ΔΔCT計算。

1.7制備肺組織單個核細(xì)胞懸液將小鼠剩余右肺剪碎，加入含有膠原酶Ⅳ(2.5 g·L-1)的RPMI 1640培養(yǎng)基2 mL，置于37℃恒溫?fù)u床消化約40 min，每隔15 min用巴氏吸管吹打混勻，將細(xì)胞懸液和未完全消化的肺組織團(tuán)塊通過200目濾網(wǎng)并研磨，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液避光孵育3 min，離心5 min，PBS洗滌3次，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸肺臟單個核細(xì)胞。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測Th1和Th2細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基將肺臟的單個核細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1×109·L-1，每1 mL細(xì)胞懸液加入PMA(25 μg·L-1)、離子霉素(1 μg·L-1)和莫能霉素，于5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)4～6 h后收集細(xì)胞，用PBS洗滌，離心棄上清，加入Percp抗CD4抗體，4℃避光孵育30 min后，用PBS洗滌，加入固定/破膜液4℃避光孵育20 min，用wash-buffer洗滌，加入PE抗IL-4抗體、APC抗IFN-γ，4℃避光孵育30 min，用PBS洗滌2次后，棄上清，用200 μL PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowjo 7.6軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1肺組織病理學(xué)表現(xiàn)如Fig 1所示，肺HE染色及PAS染色顯示，正常組小鼠支氣管形態(tài)規(guī)整，上皮細(xì)胞無增生，管壁無明顯增厚，肺泡間隔正常，支氣管及血管周圍無或少許炎性細(xì)胞浸潤，PAS染色見氣道上皮杯狀細(xì)胞少或無，無黏液滲出；哮喘組可見支氣管及血管周圍有較多炎性細(xì)胞浸潤，支氣管管腔狹窄，管壁增厚。PAS染色可見有大量杯狀細(xì)胞增生，黏液滲出較明顯。治療組與哮喘組相比，支氣管及血管周圍炎性細(xì)胞浸潤明顯降低。PAS染色見支氣管管腔內(nèi)杯狀細(xì)胞及黏液滲出明顯減少。

Fig 1 HE staining and PAS staining in lung tissues(×200)

2.2BALF中IL-4、IFN-γ的水平Fig 2的ELISA結(jié)果顯示，與正常組相比，哮喘組BALF中IL-4水平明顯升高，而IFN-γ水平明顯降低；與模型組相比，治療組BALF中IL-4水平明顯降低，而IFN-γ水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 2 IL-4 and IFN-γ levels in )

#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsasthma

2.3肺組織中T-bet、GATA-3mRNA表達(dá)如Fig 3所示，哮喘組中T-bet mRNA表達(dá)量明顯低于正常組，治療組T-bet mRNA表達(dá)量高于哮喘組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；哮喘組中GATA-3 mRNA表達(dá)量明顯高于正常組，治療組GATA-3 mRNA表達(dá)量低于哮喘組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明霧化吸入滅活草分枝桿菌可以上調(diào)哮喘小鼠T-bet表達(dá)，同時抑制GATA-3的表達(dá)。

2.4肺組織中Th1、Th2細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比如Fig 4、5所示，與正常組相比，哮喘組肺組織中Th2細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例升高，而Th1細(xì)胞所占比例下降；與模型組相比，治療組肺組織中Th2細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例下降，而Th1細(xì)胞所占比例升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示霧化吸入滅活草分枝桿菌可以調(diào)節(jié)哮喘小鼠Th1/Th2失衡。

Fig 3 The T-bet, GATA-3 mRNA expression in lungtissues measured by real-time PCR

#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsasthma

2.5肺組織中T-bet、GATA-3與Th1、Th2細(xì)胞的相關(guān)性分析肺組織T-bet mRNA和Th1細(xì)胞百分比呈明顯正相關(guān)(r=0.70，P<0.01)；GATA-3 mRNA和Th2細(xì)胞百分比呈明顯正相關(guān)(r=0.76，P<0.01)。見Fig 6。

3 討論

支氣管哮喘仍然是最常見的慢性氣道炎癥疾病，對患者的生活有重大影響，主要特點是氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑。支氣管哮喘通常發(fā)生在普通人群中，兒童較為常見，環(huán)境因素，如病毒、過敏原和職業(yè)暴露都可以加重疾病的發(fā)生。目前廣泛認(rèn)可的發(fā)病機(jī)制為Th1/Th2失衡，呈Th2優(yōu)勢應(yīng)答，Th2細(xì)胞主要產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-13，IL-4能夠促進(jìn)B細(xì)胞合成IgE，IL-5促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的聚集，IL-13促進(jìn)黏液分泌和加重氣道高反應(yīng)性。相反，IFN-γ可以促進(jìn)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的相關(guān)免疫反應(yīng)。在本實驗經(jīng)OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型中，BALF中的IFN-γ降低，IL-4表達(dá)升高，病理切片發(fā)現(xiàn)氣道炎癥細(xì)胞浸潤明顯增加，杯狀細(xì)胞增生，說明哮喘模型制備成功。

Fig 4 The representative flow cytometric dot plots of Th1 andTh2 cells in lung of normal group, asthma group and treatment group

Fig 5 Comparison of percentages of Th1 and Th2 cellsin normal group, asthma group and treatment group

#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsasthma

Fig 6 Correlation between T-betmRNA and Th1 cells, GATA-3 mRNA and Th2 cells

幼稚的T細(xì)胞通過轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3作用，分化成Th1和Th2細(xì)胞。T-bet是T-box轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，T-bet通過誘導(dǎo)STAT1信號，在Th1分化過程中促進(jìn)IFN-γ和IL-12Rβ2的表達(dá)。Finotto等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在哮喘患者的氣道中T-bet表達(dá)減少，同時在缺乏過敏原的暴露下，T-bet敲除小鼠出現(xiàn)與哮喘患者相似的表現(xiàn)，如氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性。應(yīng)用攜帶T-bet基因的重組腺相關(guān)病毒載體干預(yù)哮喘小鼠后，發(fā)現(xiàn)IL-4、IL-5降低，IFN-γ表達(dá)升高，有效減輕哮喘Th2細(xì)胞的優(yōu)勢表達(dá)[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，T-bet在Th1細(xì)胞分化中的調(diào)節(jié)功能主要是通過對GATA-3負(fù)調(diào)節(jié)，而不是促進(jìn)IFN-γ分泌。

GATA-3屬于GATA轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，GATA-3通過誘導(dǎo)Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生，上調(diào)Th2細(xì)胞的分化，還能通過抑制T-bet的表達(dá)，抑制Th1細(xì)胞信號通路。已經(jīng)證實在哮喘患者中，GATA-3的表達(dá)高于正常人[7]，促進(jìn)Th2細(xì)胞因子分泌導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性。臨床研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者淋巴細(xì)胞中IFN-γ和IL-4水平與T-bet/GATA-3比值相關(guān)，這可作為觀察哮喘患者是否有免疫失衡的客觀指標(biāo)[8]。因此，改善T-bet/GATA-3比例失衡，對于治療哮喘有重要作用[9-10]。本實驗研究中，哮喘組與正常組相比T-bet表達(dá)降低，Th1細(xì)胞因子IFN-γ分泌減少，GATA-3表達(dá)升高，向Th2細(xì)胞偏移。

滅活草分枝桿菌是一種免疫調(diào)節(jié)劑，通過增加T細(xì)胞活性，促進(jìn)Th細(xì)胞分泌B細(xì)胞分化因子和生長因子，使B細(xì)胞增殖、分化，形成特異性抗體[11]；還可以激活固有免疫系統(tǒng)如Toll樣受體[12]，增強(qiáng)NK細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[4]活性，調(diào)節(jié)機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。本課題先前的研究已經(jīng)證實了霧化滅活草分枝桿菌可以減輕OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道炎癥，通過減少IL-5、IL-13分泌，降低氣道高反應(yīng)性[13]，增加IFN-γ和減少IL-4的分泌，逆轉(zhuǎn)Th1/Th2失衡[3]，并且對于有中度持續(xù)性哮喘的成人和4～12歲小孩，用霧化吸入滅活草分枝桿菌療法是有效的[14-15]，但是其作用機(jī)制尚未完全明確。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)滅活草分枝桿菌治療后，IFN-γ、T-bet表達(dá)水平和Th1/CD4+T細(xì)胞比例較哮喘組小鼠明顯升高，而IL-4、GATA-3表達(dá)水平和Th2/CD4+T細(xì)胞比例明顯下降，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)T-bet與Th1細(xì)胞、GATA-3與Th2細(xì)胞存在正相關(guān)，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。說明滅活草分枝桿菌上調(diào)T-bet表達(dá)，促進(jìn)IFN-γ分泌，減少GATA-3表達(dá)抑制IL-4的分泌，促進(jìn)細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，減輕了哮喘的氣道炎癥。本實驗亦存在不足之處，未進(jìn)行體外實驗進(jìn)一步闡述滅活草分枝桿菌對T-bet、GATA-3的作用機(jī)制。

總之，草分枝桿菌作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，具有雙向調(diào)節(jié)作用，上調(diào)T-bet表達(dá)促進(jìn)IFN-γ分泌，抑制GATA-3表達(dá)而減少IL-4分泌。在動物和臨床研究中，已經(jīng)證實草分枝桿菌可以糾正哮喘機(jī)體的免疫失衡，但是需要進(jìn)一步研究明確草分枝桿菌是通過何種信號通路影響哮喘的發(fā)生。

(致謝：本實驗于廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗中心完成，感謝實驗室老師和同學(xué)的指導(dǎo)和幫助！)