朱瑤丹，韓錫萍，陳 震，張 鵬，馬 鑫

(江南大學(xué)藥學(xué)院和醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

在世界范圍內(nèi)，結(jié)腸癌是最為嚴(yán)重的惡性腫瘤之一[1]。目前在臨床上治療結(jié)腸癌最有效的方法是化療，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-Fu)作為結(jié)腸癌治療的基本化療藥物被廣泛應(yīng)用[2]，但是化療后的遠(yuǎn)期生存率仍不理想。高死亡率很大程度上與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)[3]，主要是因為患者對化療藥物產(chǎn)生了耐藥性[4]。盡管對腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥的研究已經(jīng)進行了很長時間，但是其復(fù)雜機制尚未完全明晰。

有研究報道，Wnt/β-catenin信號通路參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]，而在結(jié)腸癌中，Wnt/β-catenin信號通路也介導(dǎo)了結(jié)腸癌細(xì)胞的耐藥[4]。在超過80%的結(jié)腸癌中可以觀察到由于Wnt/β-catenin通路激活而導(dǎo)致細(xì)胞核中β-catenin積聚的現(xiàn)象，值得注意的是，該現(xiàn)象可能與結(jié)腸癌患者的不良預(yù)后有關(guān)[1]。

腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵步驟之一是腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲[6]，盡管大量研究發(fā)現(xiàn)很多物質(zhì)如蛋白[7]、miRNA[8]、長鏈非編碼RNA[9]等可以通過Wnt信號通路，影響細(xì)胞的遷移與侵襲能力，然而，抑制Wnt信號通路能否影響結(jié)腸癌細(xì)胞對化療藥物的耐受性，進而對細(xì)胞的遷移能力產(chǎn)生影響尚不可知。因此，本研究選用耐5-Fu人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8/5-Fu，并給予Wnt通路小分子抑制劑XAV939處理，探究Wnt信號通路與結(jié)腸癌耐藥及遷移的可能關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人結(jié)腸癌野生型細(xì)胞株HCT-8/WT、耐5-Fu人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8/5-Fu，購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.1.2試劑 XAV939、5-Fu購自Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自Gibco公司；c-Myc、cyclin D1多克隆抗體購自萬類生物公司；β-catenin、TATA結(jié)合蛋白 (TATA binding protein, TBP)單克隆抗體，購自Abcam公司；GAPDH抗體購自Bioworld 公司；羊抗鼠、羊抗兔辣根過氧化酶標(biāo)記二抗購自Proteintech公司；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.3儀器 全功能微孔板檢測儀(Bio Tek公司)；全能型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；正置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將HCT-8/WT、HCT-8/5-Fu細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、100 kU·L-1青霉素、100 g·L-1鏈霉素溶液的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2MTT法檢測細(xì)胞活力 將HCT-8/WT、HCT-8/5-Fu細(xì)胞按每孔8 000個的數(shù)量接種于96孔板，Wnt通路抑制劑組中每孔含有終濃度10 μmol·L-1的XAV939。培養(yǎng)24 h后吸棄孔中培養(yǎng)基，加入倍比稀釋的5-Fu，抑制組中每孔仍含10 μmol·L-1的XAV939。培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL MTT溶液，避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入100 μL甲臜溶解液，孵育4 h后，取出96孔板于全功能微孔板檢測儀檢測570 nm處的吸光度值。

1.2.3Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移 將孔徑8 μm的Transwell小室(BD Bioscience公司)放入配套的24孔板中，HCT-8/WT、HCT-8/5-Fu細(xì)胞重懸于無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，使其終濃度為109·L-1，在上室加入100 μL細(xì)胞懸液，在下室加入500 μL含有10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，Wnt通路抑制劑組的下室添加10 μmol·L-1XAV939，培養(yǎng)48 h后取出小室，4%多聚甲醛室溫固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min，PBS緩沖液洗滌干凈后，風(fēng)干，用顯微鏡觀察穿入下室中的細(xì)胞，隨機記錄4個視野下的細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.2.4劃痕實驗 將細(xì)胞鋪于12孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為105個，Wnt通路抑制劑組中添加10 μmol·L-1XAV939。待培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)90%，進行劃線操作，PBS洗去漂浮細(xì)胞，每孔加入含2% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在0 h和24 h給細(xì)胞拍照取樣。采用邊緣遷移距離法計算遷移率，即細(xì)胞遷移率=(邊緣距離0 h-邊緣距離24 h)/邊緣距離0 h×100%。

1.2.5Western blot檢測β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白表達(dá) 參照陳淑嫻等[10]方法，收集細(xì)胞，PBS離心洗滌細(xì)胞3次，加入RIPA裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)；細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白提取參照試劑盒說明書。檢測蛋白濃度，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液后，沸水熱變性5 min，進行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入封閉液(TBST配制的5%脫脂奶粉)室溫封閉4 h，分別加入抗β-catenin、c-Myc、cyclin D1、GAPDH、TBP一抗孵育過夜。TBST洗滌3次，每次10 min，加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌，按ECL說明書顯色，成像儀拍照。

2 結(jié)果

2.1HCT-8細(xì)胞耐藥對遷移能力的影響MTT檢測HCT-8/WT和HCT-8/5-Fu細(xì)胞對5-Fu的敏感性，由Fig 1A可見，HCT-8/WT細(xì)胞對5-Fu的IC50為40.31 mg·L-1，而HCT-8/5-Fu細(xì)胞對5-Fu的IC50為472.5 mg·L-1，耐藥指數(shù)近11.7(P<0.05)。為探討HCT-8細(xì)胞耐藥性的差異是否影響其遷移能力，用Transwell實驗和劃痕實驗檢測HCT-8/WT和HCT-8/5-Fu細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果顯示，與HCT-8/WT細(xì)胞相比，HCT-8/5-Fu細(xì)胞(藍(lán)紫色)遷移數(shù)量明顯增多(Fig 1B)，且劃痕24 h后，HCT-8/5-Fu細(xì)胞遷移能力比HCT-8/WT細(xì)胞強(Fig 1C)。以上結(jié)果說明HCT-8細(xì)胞對5-Fu的耐受性越強，其遷移能力越強。

Fig 1 Effect of drug resistance of HCT-8 cells

2.2Wnt/β-catenin通路在HCT-8細(xì)胞耐藥中的作用Western blot檢測HCT-8/WT和HCT-8/5-Fu細(xì)胞中β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白的表達(dá)。由Fig 2A可見，β-catenin在HCT-8/WT細(xì)胞中主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，而在HCT-8/5-Fu細(xì)胞中主要表達(dá)在細(xì)胞核，說明β-catenin在細(xì)胞耐藥的過程中發(fā)生了細(xì)胞質(zhì)至細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移，且Wnt/β-catenin通路下游因子c-Myc、cyclin D1在HCT-8/5-Fu細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于HCT-8/WT細(xì)胞(Fig 2B)。當(dāng)Wnt通路小分子抑制劑XAV939作用于HCT-8/5-Fu細(xì)胞后， HCT-8/5-Fu細(xì)胞核中β-catenin、細(xì)胞中c-Myc和cyclin D1蛋白表達(dá)量均降低(Fig 2C、2D)，且HCT-8/5-Fu細(xì)胞對5-Fu的耐受性下降(Fig 2E)。以上結(jié)果說明，Wnt/β-catenin通路可能參與并介導(dǎo)了HCT-8細(xì)胞的耐藥。

Fig 2 Effect of Wnt/β-catenin pathwayon drug resistance of HCT-8/5-Fu n=4)

2.3XAV939作用后HCT-8/5-Fu細(xì)胞遷移能力的變化由Fig 3A可見，與HCT-8/5-Fu細(xì)胞相比，HCT-8/5-Fu+XAV939細(xì)胞的遷移能力明顯減弱(P<0.05)，劃痕實驗結(jié)果也顯示一致(Fig 3B)，說明XAV939通過影響HCT-8/5-Fu對5-Fu的耐受性，進而影響了細(xì)胞的遷移能力。

3 討論

自20世紀(jì)80年代以來，結(jié)腸癌在中國的發(fā)病率迅速上升[11]，而腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致治療失敗的主要原因之一[12]。Wnt信號通路在結(jié)腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起著重要作用[13]，同時也介導(dǎo)了結(jié)腸癌細(xì)胞的耐藥[4]。本實驗選用人結(jié)腸癌野生型細(xì)胞株HCT-8/WT和耐5-Fu人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8/5-Fu，首先探討了兩株細(xì)胞對5-Fu的耐受性，進而觀察耐藥的差異對細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCT-8細(xì)胞對5-Fu敏感性越低，其遷移能力越強。為探討Wnt信號通路能否影響結(jié)腸癌細(xì)胞對化療藥物的耐受性，進而對細(xì)胞的遷移能力產(chǎn)生影響，本研究用Western blot實驗檢測HCT-8/WT和HCT-8/5-Fu細(xì)胞中β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白的表達(dá)水平，并在Wnt通路抑制劑XAV939處理HCT-8/5-Fu細(xì)胞后，用Western blot、MTT、Transwell和劃痕實驗分別檢測了細(xì)胞中上述蛋白的表達(dá)水平、細(xì)胞對5-Fu的耐受性和細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果顯示，Wnt/β-catenin通路可能參與并介導(dǎo)了HCT-8細(xì)胞的耐藥，其小分子抑制劑XAV939可通過抑制該通路，進而減弱耐藥細(xì)胞的遷移。

5-Fu是治療結(jié)腸癌最常用的藥物之一，但臨床上經(jīng)常觀察到患者對藥物產(chǎn)生耐受性[14]，延長治療會導(dǎo)致高轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的進展或復(fù)發(fā)[15]。因此，理解結(jié)腸癌耐藥與轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系可以為腫瘤的治療提供靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，HCT-8細(xì)胞對5-Fu耐受性的不同會導(dǎo)致細(xì)胞遷移能力的差異。

Wnt信號通路參與調(diào)節(jié)了細(xì)胞的自我更新和多種器官的形成，而該通路的紊亂會導(dǎo)致腫瘤的形成[13]。有研究報道，Wnt/β-catenin信號通路參與了結(jié)腸癌細(xì)胞的耐藥，而Wnt通路小分子抑制劑XAV939可以通過降解β-catenin，進而破壞Wnt/β-catenin信號通路[4,14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，HCT-8細(xì)胞在耐藥的過程中，其細(xì)胞核中β-catenin由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，且下游因子c-Myc、cyclin D1蛋白表達(dá)水平升高，當(dāng)XAV939作用于HCT-8/5-Fu細(xì)胞后，該細(xì)胞核中β-catenin蛋白表達(dá)減少，細(xì)胞中c-Myc、cyclin D1隨之減少，并且HCT-8/5-Fu細(xì)胞對5-Fu的敏感性提高。以上結(jié)果提示，Wnt/β-catenin通路可能參與并介導(dǎo)了HCT-8細(xì)胞的耐藥。

Fig 3 Effect of XAV939 on migrationability of HCT-8/5-Fu cells n=5)

有研究報道，很多物質(zhì)通過Wnt信號通路影響了細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，如小GTPase超家族亞族成員RhoA蛋白的失活會導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞核中累積，增強Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致增殖、侵襲和去分化，促進結(jié)直腸癌的進展和轉(zhuǎn)移[7]。microRNA-301a可以通過直接靶向同源性磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog, PTEN)，激活Wnt/β-catenin通路，調(diào)節(jié)乳腺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[8]。長鏈非編碼RNA CASC11與異構(gòu)核糖核蛋白K(heterogeneous ribonucleoprotein K, hnRNP-K)相互作用，并激活Wnt/β-catenin通路，促進結(jié)直腸癌的生長和轉(zhuǎn)移[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，Wnt通路小分子抑制劑XAV939作用于HCT-8/5-Fu細(xì)胞后，不僅可以降低細(xì)胞對5-Fu的耐受性，而且減弱了耐藥細(xì)胞的遷移能力。

綜上所述，人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8對5-Fu敏感性的差異影響了細(xì)胞的遷移能力，Wnt/β-catenin通路可能介導(dǎo)了HCT-8/5-Fu細(xì)胞的耐藥，其小分子抑制劑XAV939可減弱耐藥細(xì)胞的遷移，這一結(jié)果為臨床上結(jié)腸癌化療耐藥的治療提供了新思路。