陳孝梅 龐倩 王康 張文文 范榮莉 高夫超 陶靚 周紹春 殷玲 陳國宏 吉挺

（1 揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院，牡丹江 157041；3 黑龍江省野生動物研究所，哈爾濱 150040；4 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300）

1 前言

研究表明，蜜蜂在越冬期間會通過減少體內(nèi)自由水含量、積累抗寒物質(zhì)等方式來增強(qiáng)其耐寒能力[2]。蟲體水分含量的降低可能會誘導(dǎo)抗凍物質(zhì)的合成[3,4]，也就是說蟲體內(nèi)自由水含量越低，合成的抗凍物質(zhì)越多，抗寒能力越強(qiáng)。蜜蜂在越冬期間會通過減少體內(nèi)自由水含量，積累抗寒物質(zhì)等方式來適應(yīng)寒冷環(huán)境，增強(qiáng)其耐寒能力[2]。還有研究發(fā)現(xiàn)，蟲體內(nèi)結(jié)合脂肪含量越高，抗寒能力越強(qiáng)[5]。在越冬期昆蟲體內(nèi)有一部分游離脂肪會轉(zhuǎn)化為結(jié)合脂肪，結(jié)合脂肪會被當(dāng)作抗寒物質(zhì)儲存起來，用來抵抗嚴(yán)寒的氣候。含水量低的越冬蜂王比含水量多的處女王的耐寒能力強(qiáng)[6]，卡尼鄂拉蜂越冬蜂的耐寒性受蜜蜂體內(nèi)游離脂肪含量的影響，蜜蜂的過冷卻能力隨著體內(nèi)游離脂肪含量的增加而增強(qiáng)[7]。所以，蜜蜂體內(nèi)的自由水含量和游離脂肪含量影響并反映著其抗寒能力。

本研究對東北黑蜂和東北地區(qū)的意大利蜂體內(nèi)的自由水含量和游離脂肪含量進(jìn)行測定，并結(jié)合抗寒相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析初探蜜蜂的抗寒性能，為今后深入研究蜜蜂的抗寒性能提供理論基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 樣品采集

在吉林省國家基因庫采集東北黑蜂和東北地區(qū)的意大利蜂，2個蜂種各采集3群蜂，每群3個重復(fù)，每個重復(fù)10只工蜂。

2.2 主要試劑

氯仿（分析純）、甲醇（分析純）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Trizol（Invitrogen公司），氯仿，異丙醇，乙醇，DEPC水，F(xiàn)astQuant RT Kit（with gDNase）FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒（KR106），AceQ qPCR SYBR Green Master Mix熒光定量試劑盒（Vazyme），無酶水。

表1 目的基因信息及引物序列

2.3 主要儀器

50ml離心管，培養(yǎng)皿（φ=8cm），100ml量筒，研杵，分析天平，烘箱，超低溫冰箱，低溫高速離心機(jī)；低溫高速離心機(jī)，PCR儀（Eppendorf），熒光定量PCR儀（Thermos fisher scientific）。

2.4 試驗(yàn)步驟

2.4.1 自由水含量和游離脂肪含量測定

① 將樣品4℃固定后，測定樣品的鮮重（FM），然后放入60℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥48h；

② 測定干燥后的樣品干重（DM），則自由水含量=（FM-DM）/FM×100%；

③ 取干燥后的單只樣品于玻璃勻漿器中，加入3ml氯仿和甲醇提取液（氯仿∶甲醇=2∶1），充分研磨成勻漿；

注射降植烷6個月后，取造模成功的小鼠40只，隨機(jī)分為模型組、陽性對照組（潑尼松，5 mg/kg）和環(huán)孢素高、低劑量組（30、10 mg/kg），每組10只。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，陽性對照組和環(huán)孢素各劑量組小鼠灌胃相應(yīng)劑量的藥物，每天1次，每周5次（固定在周一至周五早上9點(diǎn)給藥），連續(xù)18周；模型組和正常對照組小鼠同法給予等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)過程中，除模型組小鼠死亡4只、環(huán)孢素低劑量組小鼠死亡1只外，其余組小鼠均全部存活。記錄實(shí)驗(yàn)過程中小鼠體質(zhì)量變化情況。

④ 將勻漿液轉(zhuǎn)移至5ml離心管中，離心（4500r，10min）；

⑤ 棄上清，向沉淀中加入3ml氯仿和甲醇提取液（氯仿∶甲醇=2∶1），離心（4500r，10min）；

⑥ 棄上清，將沉淀于60℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重（LDM），則游離脂肪含量=(DM-LDM)/DM×100%。

2.4.2 抗寒相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析

采集東北黑蜂、東北地區(qū)的意大利蜂，分別采集其工蜂的頭胸部提取RNA，根據(jù)FastQuant RT Kit（with gDNase）FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒（KR106）操作說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再根據(jù)AceQ qPCR SYBR Green Master Mix熒光定量試劑盒（Vazyme）的使用說明書進(jìn)行操作，配制20μl qPCR反應(yīng)體系：AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10.0μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，ROX Reference Dye 2 0.4μl，模板DNA 2.0μl，滅菌蒸餾水6.8μl。qPCR的反應(yīng)程序是首先進(jìn)行95℃預(yù)變性5min，然后是循環(huán)反應(yīng)階段，即95℃ 10s，60℃ 30s，40個循環(huán)，最后是構(gòu)建融解曲線，即進(jìn)行“95℃15s，60℃ 60s，95℃ 15s”的反應(yīng)。利用2-ΔΔCt的方法計(jì)算基因的相對表達(dá)量，利用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用ANOVA的LSD法進(jìn)行顯著性分析，以0.05為顯著性水平。參考前人的研究[8,9]選擇2個主要目的基因，然后根據(jù)熒光定量引物的設(shè)計(jì)原則，通過NCBI的Pick Primers分析程序在線設(shè)計(jì)目的基因的引物序列，目的基因信息及引物序列見表1。

3 結(jié)果與分析

3.1 自由水含量和游離脂肪含量測定結(jié)果

由圖1可以看出，東北黑蜂的自由水含量與東北地區(qū)意大利蜂的自由水含量無顯著性差異，東北黑蜂的游離脂肪含量與東北地區(qū)意大利蜂的游離脂肪含量也無顯著性差異，說明這2個蜂種的自由水含量和游離脂肪含量不存在差異。

圖1 自由水含量和游離脂肪含量測定結(jié)果

3.2 抗寒相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果

根據(jù)前人的研究結(jié)果，篩選了Hsc70-4和HSP602個主要目的基因進(jìn)行熒光定量PCR分析，RNA分別提取自東北黑蜂、東北地區(qū)的意大利蜂工蜂的頭胸部。結(jié)果顯示，東北黑蜂HSP 60和Hsc70-4基因的表達(dá)量與東北地區(qū)的意大利蜂差異不顯著（P＞0.05）（圖2）。

圖2 抗寒相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果

4 討論

4.1 自由水含量和游離脂肪含量測定

東北黑蜂和東北地區(qū)意大利蜂的自由水含量和游離脂肪含量均不存在差異，說明東北黑蜂與東北地區(qū)的意大利蜂在越冬時(shí)，其體內(nèi)與抗寒有關(guān)的自由水含量和游離脂肪含量基本一致，也就是說這2個蜂種在應(yīng)對冷脅迫時(shí)具有相似的抗寒機(jī)制。因此推測長期生活在東北地區(qū)的意大利蜂為適應(yīng)低溫環(huán)境也形成了一定的抗寒能力，說明意大利蜂也是有抗寒潛質(zhì)的，體現(xiàn)了蜜蜂對低溫環(huán)境的適應(yīng)性，其抗寒性能可能受到環(huán)境的影響。

4.2 抗寒相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析

為進(jìn)一步探究蜜蜂與抗寒相關(guān)基因表達(dá)量的差異，本研究對東北黑蜂和東北地區(qū)的意大利蜂的2個抗寒相關(guān)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。結(jié)果表明，東北黑蜂HSP60和Hsc70-4基因的表達(dá)量與東北地區(qū)的意大利蜂差異不顯著（P＞0.05）。熱激蛋白（HSPs）又稱熱休克蛋白，是生物體受到不良刺激或應(yīng)激條件下產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，按照分子量大小，HSPs分為大分子HSP（100～110kD）、HSP90（83～90kD）、HSP70（66～78kD）、HSP60以及小HSP（sHSP，12～34kD）5個家族，HSP70又包括hsc70-1、hsc70-2、hsc70-3、hsc70-4和hsc70-55個組成性成員。研究表明，當(dāng)機(jī)體受到冷脅迫或熱脅迫時(shí)，體內(nèi)熱激蛋白的表達(dá)量會明顯升高[10]。研究顯示，HSP70對果蠅的壽命具有一定的影響[11,12]，其高表達(dá)能夠延長變異線蟲的壽命[13]，而擁有較長的壽命是越冬蜂的重要特點(diǎn)。東北黑蜂HSP60和Hsc70-4基因的表達(dá)量與東北地區(qū)的意大利蜂差異不顯著，說明在應(yīng)對冷脅迫時(shí)，蜜蜂體內(nèi)相關(guān)抗寒基因的表達(dá)量無明顯差異，猜測可能是因?yàn)闁|北地區(qū)的意大利蜂因長期生活在寒冷的東北地區(qū)，對低溫環(huán)境產(chǎn)生了適應(yīng)性，形成了一定的抗寒能力，因此初步認(rèn)為蜜蜂的抗寒能力可能受環(huán)境影響，東北黑蜂的抗寒性可能是其對低溫環(huán)境的一種適應(yīng)性。

5 結(jié)論

本研究通過測定自由水含量和游離脂肪含量以及熒光定量PCR分析，結(jié)果表明，東北黑蜂的自由水含量與東北地區(qū)意大利蜂的自由水含量和游離脂肪含量均無顯著性差異（P＞0.05）；抗寒相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明，東北黑蜂HSP60和Hsc70-4基因的表達(dá)量與東北地區(qū)的意大利蜂差異不顯著（P＞0.05）。說明長期生存在東北地區(qū)的意大利蜂也形成了一定的抗寒能力，推測東北黑蜂的抗寒性是其對環(huán)境的一種適應(yīng)性，蜜蜂的抗寒能力可能受環(huán)境影響。