，

隨著我國居民生活水平不斷提高，腦梗死發(fā)病率呈現(xiàn)增長趨勢，已連續(xù)5年成為第二位的死亡原因，且具有極高的致死率、致殘率及復發(fā)率[1]。急性腦梗死(ACI)是臨床常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，對人類的生命健康及生存質(zhì)量造成嚴重威脅。大量研究表明，腦血管病經(jīng)搶救存活者，大部分留有不同程度的致殘性后遺癥，如半身不遂、構(gòu)音障礙、智力減退等，嚴重影響病人回歸家庭、工作和社會，帶來經(jīng)濟和精神的雙重壓力[2]。目前臨床治療急性腦梗死的主要手段為溶栓，其目的是恢復病變組織的血流及挽救缺血半暗帶的血供，但其存在嚴格的窗口期，在臨床受到一定的限制[3]。隨著頭皮針治療腦血管病研究的快速發(fā)展，早期或超早期針灸治療急性腦梗死已成為針灸界研究方向。本研究根據(jù)頭穴的歸經(jīng)與主治，以百會透前頂、率谷透懸厘，并手指捻針為治療方法，觀察神經(jīng)功能缺損情況、CD40與CD40L表達量與凋亡關系，探討頭針透刺法對腦組織神經(jīng)細胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 雄性健康Wistar大鼠[湖北省實驗動物研究中心，合格證號：SCXK(鄂)2008- 0005]60只，體重200 g±20 g。所有大鼠均在實驗室常規(guī)飼養(yǎng)適應1周，采用隨機數(shù)字表分為頭針透刺組、模型對照組和假手術組，各組又分為7 d和14 d兩個亞組，每個亞組10只大鼠，用苦味酸標記并編號。

1.2 實驗主要試劑與儀器 華佗牌無菌針灸針(規(guī)格：0.20 mm×25 mm，標準號：GB2024- 1994，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，酶聯(lián)免疫吸附法測定(ELISA)試劑盒(美國R&D System公司提供，晶美生物工程有限公司)；濃縮型兔抗人CD40與CD40L單克隆抗體(一抗)、酶標抗鼠/兔聚合物(二抗，購自上海雅吉生物科技有限公司)；即用型免疫組化Elivision TM plus試劑盒、DAB顯色試劑盒及磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS；購自上海一研生物科技有限公司)，sCD40L濃度單位為ng/mL，靈敏度0.156。一端經(jīng)過石蠟制備后的釣魚線(長度為15 mm)。低速控溫離心機(上海趙迪離心機設備有限公司)，醫(yī)用低溫電冰箱、水浴箱、酶標儀、切片機(德國ZEISS公司)、光學顯微鏡(美國)。

1.3 模型制備 參照改良Zea Longa法制備一側(cè)大腦中動脈阻塞(MCAO)動物模型[4]。術前準備及手術步驟：術前禁食不禁水12 h，隨后稱重計數(shù)。用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.35 mL/kg)，大鼠麻醉后將其固定于操作臺上，頸部常規(guī)備皮消毒后，取頸前左旁中切口，剪開闊筋膜，顯露左側(cè)胸鎖乳突肌，從胸鎖乳突肌和頸前部肌群間向深部分離即達到頸總動脈(CCA)，用血管鉗將皮膚及皮下組織向兩側(cè)牽開，用眼科鑷子小心游離左側(cè)CCA、頸外動脈(ECA)及頸內(nèi)動脈(ICA)；結(jié)扎ECA及CCA近心端，不剪斷ECA，不結(jié)扎翼腭動脈，以動脈夾夾閉ICA；用5- 0頭皮針于CCA結(jié)扎的遠心端(距CCA分叉處2 mm～3 mm)刺一小口導入栓塞線，松開ICA動脈夾，調(diào)整插線方向及角度，栓線經(jīng)CCA順利進入ICA，直至大腦前動脈起始部，遇到阻力停止，長度20 mm～22 mm，用縫合線系住栓塞線；確認無出血后逐層縫合皮膚，傷口局部外用青霉素消炎。假手術組僅分離各動脈而不結(jié)扎插線，大鼠蘇醒后，有以下表現(xiàn)即表示造模成功：提尾時左側(cè)前肢內(nèi)收屈曲；右眼Horner征；爬行時向左側(cè)劃圈；左側(cè)肢體的疼痛回縮或消失，均可列入實驗研究。依照Zea- Longa 5級評分法[5]，0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：輕微神經(jīng)功能缺損，不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，向?qū)?cè)劃圈；3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺損，向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識水平下降。選取1分～3分大鼠納入實驗，其余剔除，并隨時補足實驗所缺大鼠，保證實驗大鼠例數(shù)。

1.4 干預方法 頭針透刺法：透刺穴位均按照華興邦制定《動物針灸穴位圖譜》[6]，選取大鼠百會穴、前頂穴、率谷穴和懸厘穴。大鼠造模成功24 h后，將其仰臥并固定于操作臺上，實施頭針透刺法。具體操作方法：首先常規(guī)皮膚消毒，用0.20 mm×25 mm毫針，取百會向前透刺1.5寸至前頂穴，病灶側(cè)率谷穴向前下方透刺1.5寸至懸厘穴，并以200 r/min速度捻針，持續(xù)捻轉(zhuǎn)3 min，留針30 min，期間捻轉(zhuǎn)3次。刺激時長為每日1次，每次30 min，根據(jù)術后時間確定治療療程分別為7 d和14 d。其余兩組大鼠每日相同時間固定于操作臺上30 min，不進行任何干預，療程與頭針透刺組相同。

1.5 取材 大鼠干預最后1 d針刺或固定30 min后，先進行評分，之后迅速脫臼處死，取出大腦，用冰凍PBS清洗組織表面血液，取缺血側(cè)大腦的顳葉組織，石蠟切片，所有蠟塊均連續(xù)切片為4 μm厚度，每個蠟塊切兩張，進行HE染色及免疫組化檢測。取大鼠股動脈血，用抗凝管進行收集，之后用離心機以2 000 r/min離心10 min，用移液槍吸取中間黃衣層置于EP管內(nèi)，之后放入-20 ℃冰箱中備用。

1.6 觀察指標及方法

1.6.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 待各組大鼠蘇醒后對其進行神經(jīng)功能缺損評分，治療后進行神經(jīng)功能評分，并記錄實驗數(shù)據(jù)。

1.6.2 大鼠血清sCD40L測定 采用雙抗體夾心ELISA，所有標本收集后嚴格按照說明書進行操作。

1.6.3 大鼠腦組織病理學觀察 將已制備好的石蠟切片進行HE染色，在光學顯微鏡下進行觀察。

1.6.4 采用免疫組化法測定腦組織CD40、CD40L表達[7]將已制備好的石蠟切片，微波修復抗原，之后以濃度為3%的H2O2液室溫下孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶活性，PBS沖洗，加入一抗(工作濃度為1∶100)，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗，加入聚合物增強劑，室溫孵育20 min，PBS沖洗，加入二抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗后，DAB顯色，蘇木精復染，0.1%鹽酸分化，PBS返藍，常規(guī)脫水透明，中性樹脂封固。每批次均設陽性對照片1張(由試劑公司提供空白石蠟切片)，PBS液取代一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：以細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色至深棕色顆粒為陽性細胞。陽性細胞符合以下標準：細胞結(jié)構(gòu)清晰可見；棕黃色至深棕色顆粒定位準確；著色明顯高于背景，比較清楚。A記分方式：按顯色細胞數(shù)計分，陽性細胞數(shù)<1/3計1分，陽性細胞數(shù)為1/3～2/3計2分，陽性細胞數(shù)>2/3計3分；B計分方式：按細胞顯色深淺計分，無陽性反應細胞計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。總分數(shù)=A×B，A×B=0判斷為(-)，A×B=1～2判斷為(+)，A×B=3～4判斷為(++)，A×B=6～9判斷為(+++)。至少隨機觀察5個～10個高倍鏡視野(放大倍數(shù)為×400)。

2 結(jié) 果

2.1 各組Zea- Longa評分比較 頭針透刺組評分隨治療時間延長逐漸降低，模型對照組14 d時略有下降。頭針透刺組與模型對照組比較，7 d組與14 d組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明頭針透刺法能顯著改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀；頭針透刺組7 d亞組與14 d亞組評分進行比較，隨著時間增加，評分降低，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明頭針透刺法對改善腦梗死大鼠行為學有重要作用，且隨著時間延長，行為學改善越明顯。模型對照組亞組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。此評分為每個亞組最后1 d處置后的評分。詳見表1。

表1 各組Zea- Longa評分比較(±s) 分

2.2 各組大鼠血清sCD40L表達比較 假手術組與其他各組相比，sCD40L表達最低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；模型對照組14 d亞組與7 d亞組比較，sCD40L含量略有下降，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；頭針透刺組14 d亞組與7 d亞組比較，sCD40L含量明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且分別與模型對照組兩個亞組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組血清sCD40L表達比較(±s) ng/mL

2.3 腦組織病理學觀察 假手術組大鼠腦組織無缺血性表現(xiàn)，組織形態(tài)正常，細胞排列、結(jié)構(gòu)形態(tài)規(guī)整，基本無細胞病變及壞死現(xiàn)象。模型對照組7 d亞組大鼠腦缺血區(qū)細胞數(shù)量明顯減少，細胞排列松散，細胞間隙增寬，神經(jīng)元胞漿及胞膜形態(tài)不規(guī)則、邊界不清，呈缺血樣病理改變，可見細胞核明顯固縮，空泡樣變性壞死數(shù)量較多；14 d亞組大鼠腦缺血區(qū)神經(jīng)元細胞稍有增多，固縮和空泡樣改變稍減少，細胞間隙改善不明顯。頭針透刺組7 d亞組大鼠腦缺血區(qū)細胞數(shù)量減少，細胞排列較松散，神經(jīng)元胞漿及胞膜形態(tài)不規(guī)則、邊界不清，與模型對照組7 d亞組細胞形態(tài)學改變相當；14 d亞組與模型對照組14 d亞組大鼠比較，神經(jīng)細胞排列層次稍欠整齊，固縮、空泡樣變和細胞間隙明顯改善，與同組7 d亞組大鼠比較可見神經(jīng)細胞壞死數(shù)量明顯減少。頭針透刺組中的14 d亞組總體與假手術組相差不大。

2.4 各組大鼠腦組織CD40和CD40L表達比較 模型對照組與假手術組比較，大鼠腦組織CD40、CD40L含量均增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；頭針透刺組14 d亞組與7 d亞組比較，腦組織CD40、CD40L含量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且14 d亞組與假手術組14 d亞組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。以上結(jié)果說明頭針透刺法能充分抑制腦梗死大鼠CD40、CD40L的表達，其中以14 d組效果最佳。詳見表3、表4。

表3 各組大鼠腦組織CD40表達比較(±s)

表4 各組大鼠腦組織CD40L表達比較(±s)

3 討 論

急性腦梗死病人起病較急，一般在安靜狀態(tài)下或睡眠時發(fā)病，起病后數(shù)小時或1 d～2 d內(nèi)達到高峰。常見的臨床癥狀主要有頭痛、眩暈、耳鳴、半身不遂、吞咽困難等，嚴重時導致昏迷不醒[8]。動脈粥樣硬化(atherosclerotic，AS)是導致腦梗死的主要原因，CD40/CD40L過度表達激發(fā)免疫和炎癥反應，導致粥樣斑塊內(nèi)局部炎癥細胞浸潤，促發(fā)斑塊破裂，進而發(fā)生腦梗死。CD40/CD40L信號通路在AS炎癥免疫調(diào)節(jié)中作用明確，兩者相互作用參與AS斑塊內(nèi)主要細胞成分的炎癥反應調(diào)節(jié)[9]。CD40/CD40L是一對互補跨膜糖蛋白，分別屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)及腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員，作為炎性和免疫反應的重要信號傳導通路，參與調(diào)控免疫、炎癥、高凝等多種病理狀態(tài)，可激活炎癥反應、活化血小板，導致內(nèi)皮功能障礙等[10]。CD40/CD40L結(jié)合可促進細胞間黏附分子- 1(intercellular adhesion molecule- 1，ICAM- 1)和血管細胞黏附分子- 1(vascular cell adhesion molecule- 1，VCAM- 1)表達上調(diào)，介導活化血小板或內(nèi)皮細胞與中性粒細胞和單核細胞黏附，進一步引起血管功能失調(diào)和組織損傷。CD40/CD40L系統(tǒng)上調(diào)促進炎癥反應，為粥樣斑塊破裂和血栓形成創(chuàng)造有利環(huán)境[11]。

目前認為，急性腦梗死所致肢體運動功能障礙，越早進行康復治療效果越明顯[12- 13]。頭針是針灸常用的方式，頭皮透刺法已廣泛應用于缺血性腦病治療，通過頭針應用能有效促進病人大腦局部的血液流通，明顯增加受損部位的血流量，促進腦組織功能的恢復[14]。焦順發(fā)[15]認為，大腦皮層的功能與其相對應的頭針刺激區(qū)密切相關，針刺這些刺激區(qū)可調(diào)節(jié)與其相應的大腦皮層的功能。于致順研究認為，針刺對大腦神經(jīng)細胞的電生理功能具有明顯調(diào)節(jié)作用，能恢復抑制的大腦神經(jīng)細胞興奮性和中樞傳導時間[16]。頭皮透刺法目前已廣泛應用于缺血性腦病治療，古人云：“急則用針，緩則用藥”“藥之不及，針之所為”?！夺樉拇蟪伞份d：“卒暴中風，頂門、百會”“初中風跌倒……，不省人事，牙關緊閉，藥水不下，急以三棱針刺手十二井，當去惡血……乃起死回生妙訣”，提出中風早期運用針灸治療且療效肯定。中醫(yī)認為，腦為髓海，元神之府，諸陽之會。頭皮針能刺激頭部經(jīng)絡，也能刺激大腦皮質(zhì)功能在頭皮的投射區(qū)，以促進腦細胞功能恢復[17]。有研究認為，頭針可啟動大腦兩側(cè)血液的代償機制，調(diào)節(jié)大腦兩側(cè)血液，從而改善腦部供血[18]。

本研究運用頭針透刺法對急性腦梗死大鼠進行治療，選取百會向前透刺前頂穴，病灶側(cè)率谷穴向前透刺懸厘穴。百會透前頂縱跨額頂葉交界處中線，位于大腦前動脈主干投影區(qū)，對改善大腦前動脈的血液循環(huán)，興奮皮質(zhì)運動區(qū)、皮質(zhì)感覺區(qū)有重要意義；率谷透懸厘斜行于顳葉、額葉下部，位于大腦中動脈皮層支主干和分支顳前、中、后動脈支配區(qū)的投影處，刺激此區(qū)域?qū)Ω纳拼竽X中動脈的血液循環(huán)有較好的作用[19]。本實驗模型對照組各亞組較假手術組各亞組CD40、CD40L表達明顯增多，頭針透刺組各亞組較模型對照組各亞組CD40、CD40L表達明顯減少，其中以14 d亞組更顯著，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。證實頭針透刺法通過抑制CD40/CD40L炎癥信號通路傳導，抑制一系列炎癥反應，起到保護腦組織作用，最終改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能，提高生存質(zhì)量。

綜上所述，抑制CD40/CD40L表達可能是頭針透刺法預處理大鼠腦梗死，抑制神經(jīng)元凋亡、保護腦組織作用的重要機制之一。關于其他作用機制或途徑，需要進一步研究探索。