，，，

隨著中國人口老齡化問題加劇，近20年來缺血性心臟病引起的死亡率上升到各種致死疾病的第二位[1]。有研究顯示，缺血性心臟病死亡年齡段主要集中在70歲～79歲的老年后期，該階段缺血性心臟疾病的病死率為653.2/10萬[2]。隨著冠狀動脈搭橋術(shù)(CABG)、經(jīng)皮冠狀動脈內(nèi)成形術(shù)(PTCA)、溶栓療法等灌流再通技術(shù)的廣泛應(yīng)用[3]，導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)病人日益增多。線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要場所，為細(xì)胞的活動提供能量，稱為“細(xì)胞動力工廠”，線粒體也是氧自由基(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生的主要來源和損傷的主要靶點[4- 5]。正常線粒體的膜電位(mitochondrialtransmembrane potential，MMP)是維持線粒體進行氧化磷酸化、產(chǎn)生ATP的先決條件，線粒體膜電位的改變直接反映線粒體功能的變化。線粒體膜電位的降低啟動細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，是細(xì)胞凋亡的早期敏感特征[6]。MIRI發(fā)生時產(chǎn)生大量ROS并快速覆蓋細(xì)胞內(nèi)源性自由基清除系統(tǒng)，使細(xì)胞及線粒體膜脂質(zhì)過氧化，破壞線粒體膜的完整性，通透性增加，線粒體膜電位降低，導(dǎo)致線粒體功能障礙，繼而ATP生成減少，鈣泵失活引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載[7]，線粒體呼吸鏈功能障礙使ROS過量產(chǎn)生得不到及時清除，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生不可逆損傷或凋亡。本研究采用厭氧培養(yǎng)箱法制備大鼠心肌缺氧復(fù)氧損傷模型，以大鼠心肌細(xì)胞為研究對象并用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域4- 銅鋅超氧化物歧化酶(PTD4- Cu/ZnSOD)融合蛋白干預(yù)，通過電子顯微鏡結(jié)合生化檢測方法，觀察大鼠心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，與能量代謝相關(guān)的線粒體ATP酶及與自由基清除、脂質(zhì)過氧化相關(guān)的線粒體超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量。采用Western blot測定大鼠心肌細(xì)胞B淋巴細(xì)胞瘤- 2基因(Bcl- 2)和BAX表達(dá)的表化并對其機制進行研究，從線粒體水平探討PTD4- Cu/ZnSOD融合蛋白對缺氧復(fù)氧損傷心肌的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器 大鼠心肌細(xì)胞H9C2，購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)。主要試劑：PTD4- Cu/ZnSOD融合蛋白，上海生物工程有限公司；Cu/ZnSOD融合蛋白，上海生物工程有限公司；線粒體膜電位JC- 1檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；ATP酶測定試劑盒(高速)，南京建成生物工程研究所；MDA測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；SOD測定試劑盒、BAX抗體、Bcl- 2抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒、β- actin抗體，南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器：HW- 1000超級恒溫水浴箱，成都泰盟科技有限公司；DT系列電子天平，中國江蘇常熟長青儀器儀表廠；D- 37520低溫高速離心機，德國Heraeus公司；低溫離心機，Eppendorf(德國)；熒光顯微鏡，Olympus(日本)；超凈工作臺，Thermo(美國)；微量移液器，EPpendorf(德國)；超純水系統(tǒng)，Millipore(美國)；凝膠數(shù)字圖像分析儀，美國；電泳儀(MINI- PROTEAN 3 BIO- RAD)，德國；伯樂半干轉(zhuǎn)膜儀，BIO- RAD；脫色搖床，海門市麒麟醫(yī)用儀器廠有限公司；全自動酶標(biāo)儀(Multiskan MK3)，上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 缺氧復(fù)氧模型建立及分組 6孔板中的細(xì)胞在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換液，細(xì)胞長滿至80%后，使用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗，再加入不含血清的低糖氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)，置入85%N2，10%H2，5%CO2的37 ℃飽和濕度厭氧培養(yǎng)箱。培養(yǎng)4 h后取出，完成缺氧。缺氧后，加入新鮮含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，完成復(fù)氧。將培養(yǎng)的細(xì)胞隨機分為4組，正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞作為正常組。在缺氧復(fù)氧損傷的細(xì)胞培養(yǎng)液中不加任何處理因素作為HRI組，加入10 μmol/L的PTD4- Cu/ZnSOD融合蛋白作為PTD4- Cu/ZnSOD組，加入10 μmol/L的Cu/ZnSOD融合蛋白作為Cu/ZnSOD組，之后共同孵育30 min。

1.2.2 線粒體膜電位檢測 吸出每孔的培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞1次，加入1 mL培養(yǎng)液。加入1 mL JC- 1染色工液，充分混勻，37 ℃孵育20 min。孵育期間按1 mL JC- 1染色緩沖液(5×)加入4 mL蒸餾水比例，配制JC- 1染色緩沖液(1×)，放置冰浴。37 ℃孵育結(jié)束后，吸去上清液，用JC- 1染色緩沖液洗滌2次(冰浴)。熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測 4%的多聚甲醛固定細(xì)胞30 min～60 min，之后用PBS洗滌3次，每次5 min。加入含0.2%的TritonX- 100的PBS，冰浴5 min。PBS洗滌2次，每次5 min。滴加100 μL的平衡緩沖液(equilibration buffer)于樣本區(qū)域上，室溫平衡5 min～10 min。滴加100 μL的末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase，TdT)酶反應(yīng)液于樣本區(qū)域上，于37 ℃濕盒中孵育60 min。樣本放入20×SSC溶液的染色缸中終止反應(yīng)，加入100 μL的本辣根過氧化物酶標(biāo)記Streptavidin(HRP- labeled Streptavidin，HRP- Streptavidin)室溫孵育30 min。室溫顯色30 s至5 min，最后用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木素復(fù)染30 s至1 min，脫水后封片。顯微鏡下觀察凋亡的細(xì)胞顯色為棕褐色。

1.2.4 線粒體ATP酶檢測 將不同處理的心肌細(xì)胞棄去培養(yǎng)液后，分別用細(xì)胞收集液作用2 min～3 min，收集細(xì)胞，以6 000 r/min離心15 min。棄上清液，之后加細(xì)胞勻漿液，用勻漿器勻漿，將勻漿后的液體置于離心管配平后放入普通離心機，以2 500 r/min離心15 min，緩慢吸取上清液，移入高速離心管中，以17000 r/min離心20 min，棄上清液，留取沉淀物。加入0.25 mol/L蔗糖與0.003 mol/L氯化鈣液1 mL，用吸管吹打成懸液，以17 000 r/min離心20 min，將上清液吸入另一試管中，留取沉淀物，加入0.1 mL 0.25 mol/L蔗糖與0.003 mol/L氯化鈣溶液混勻成懸液，即得線粒體懸液。BCA法測定蛋白濃度。

1.2.5 線粒體SOD含量檢測 將不同處理的心肌細(xì)胞棄去培養(yǎng)液后，分別用細(xì)胞收集液作用2 min～3 min，將細(xì)胞收集起來，6 000 r/min離心15 min。棄上清液，之后加細(xì)胞勻漿液，用勻漿器勻漿，將勻漿后的液體置于離心管配平后放入普通離心機，以2500 r/min離心15 min，緩慢吸取上清液，移入高速離心管中，以17 000 r/min離心20 min，棄上清液，留取沉淀物。加入0.25 mol/L蔗糖與0.003 mol/L氯化鈣液1 mL，用吸管吹打成懸液，以17 000 r/min離心20 min，將上清液吸入另一試管中，留取沉淀物，加入0.1 mL 0.25 mol/L蔗糖與0.003 mol/L氯化鈣溶液混勻成懸液，即得線粒體懸液。取部分線粒體懸液用1×PBS(pH7.4)稀釋20倍用于之后的檢測。

1.2.6 線粒體MDA含量檢測 將不同處理的心肌細(xì)胞棄去培養(yǎng)液后，分別用細(xì)胞收集液作用2 min～3 min，將細(xì)胞收集起來，6 000 r/min離心15 min。棄上清液，之后加細(xì)胞勻漿液，用勻漿器勻漿，將勻漿后的液體置于離心管配平后放入普通離心機，以2500 r/min離心15 min，緩慢吸取上清液，移入高速離心管中，以17 000 r/min離心20 min，棄上清液，留取沉淀物。加入0.25 mol/L蔗糖與0.003 mol/L氯化鈣液1 mL，用吸管吹打成懸液，以17 000 r/min離心15 min，將上清液吸入另一試管中，留取沉淀物，加入0.1mL 0.25 mol/L蔗糖與0.003 mol/L氯化鈣溶液混勻成懸液，即得線粒體懸液。再用渦旋混勻器混勻，試管口用保鮮膜扎緊，用針頭刺一小孔，95 ℃水浴40 min，取出后，流水冷卻，之后3 500 r/min離心10 min。取上清液，535 nm處測定各管吸光度值。

1.2.7 Western檢測BCL- 2、BAX蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞后用含酶抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑進行細(xì)胞裂解，裂解液于預(yù)冷的離心機14 000 r/min離心15 min，收集上清液。用BCA蛋白定量法進行蛋白質(zhì)濃度測定。計算含50 μg蛋白的溶液體積即為上樣量，加入上樣總體積20 mL，100 ℃變性5 min，根據(jù)蛋白分子量配制12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)。根據(jù)預(yù)染maker判斷目的蛋白充分分離后，停止電泳。取出凝膠切下目的條帶，用蒸餾水沖洗，剪與PAGE凝膠相同大小的聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)和濾紙，PVDF膜甲醇浸泡數(shù)秒后與濾紙一起浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中。按照黑色版—纖維墊—濾紙—凝膠—PVDF膜—濾紙—纖維墊—白色版依次放好，夾緊板后放入轉(zhuǎn)膜儀內(nèi)。轉(zhuǎn)膜條件：BAX，BCL- 2，200 mA，40 min。用含5%脫脂奶粉的封閉液浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h。用封閉液稀釋一抗，使PVDF膜浸泡于孵育液中，4℃孵育過夜。BAX，1︰600稀釋；BCL- 2，1︰600稀釋。用封閉液稀釋HRP標(biāo)記的二抗，使PVDF膜浸泡于孵育液中，室溫?fù)u床孵育2 h。ECL顯色。X光片顯影，掃描，照片。應(yīng)用凝膠圖像掃描系統(tǒng)對顯影膠片進行吸光度掃描，結(jié)果以目標(biāo)蛋白條帶吸光度與對內(nèi)參條帶吸光度比值表示。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細(xì)胞線粒體膜電位檢測 正常的心肌細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，無綠色熒光呈現(xiàn)(無線粒體膜電位下降)。PTD4- Cu/ZnSOD組紅色熒光明顯強于HRI組、Cu/ZnSOD組，而Cu/ZnSOD組相較HRI組紅色熒光增強不明顯，說明缺氧復(fù)氧損傷后，大部分心肌細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，線粒體膜電位下降較明顯，Cu/ZnSOD不能減輕線粒體膜電位的下降趨勢，PTD4- Cu/ZnSOD可明顯減輕線粒體膜電位的降低。詳見圖1。

正常組 HRI組 Cu/ZnSOD組 PTD4- Cu/ZnSOD組

2.2 各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、總ATP酶、MDA含量、SOD活性比較 HRI組心肌細(xì)胞棕褐色的凋亡細(xì)胞明顯多于正常組；PTD4- Cu/ZnSOD組棕褐色凋亡細(xì)胞明顯少于HRI組，詳見圖2。HRI組、Cu/ZnSOD組、PTD4- Cu/ZnSOD組的凋亡指數(shù)、MDA含量、均明顯高于正常組，總ATP酶、SOD含量均明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Cu/ZnSOD組與HRI組凋亡指數(shù)、總ATP酶、MDA含量及SOD活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；PTD4- Cu/ZnSOD組凋亡指數(shù)、MDA含量明顯低于HRI組、Cu/ZnSOD組；總ATP酶、SOD活性明顯高于HRI組、Cu/ZnSOD組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。詳見表1。

正常組 HRI組 Cu/ZnSOD組 PTD4- Cu/ZnSOD組

表1 各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、總ATP酶、MDA含量、SOD活性比較(±s)

2.3 Western檢測Bcl- 2、Bax蛋白的表達(dá) 各組心肌細(xì)胞中均有Bcl- 2、Bax蛋白的表達(dá)。HRI組、Cu/ZnSOD組、PTD4- Cu/ZnSOD組Bcl- 2表達(dá)水平均明顯低于正常組，Bax蛋白表達(dá)明顯高于正常組(P<0.05)。PTD4- Cu/ZnSOD組Bcl- 2表達(dá)水平明顯高于HRI組、Cu/ZnSOD組，BAX表達(dá)水平則明顯較低(P<0.05)。HRI組與Cu/ZnSOD組Bcl- 2、Bax表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2、圖3。

表2 各組心肌細(xì)胞Bcl- 2、Bax蛋白水平表達(dá)比較(±s) pg/mL

圖3 各組心肌細(xì)胞BCL- 2與BAX蛋白的表達(dá)

3 討 論

ATP酶作為一種逆化學(xué)梯度轉(zhuǎn)運的蛋白酶在細(xì)胞膜、線粒體膜及微粒體膜上廣泛存在，其能將ATP催化水解成為ADP且釋放一定的能量，其中Na+- K+- ATP酶及Ca2+- ATP酶對維持心肌細(xì)胞線粒體的形態(tài)、離子濃度梯度的平衡具有重要的作用[7- 9]。存在于心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)膜的ATP酶對維持線粒體膜內(nèi)外離子濃度平衡起重要作用。心肌缺氧復(fù)氧損傷的過程，細(xì)胞能量代謝出現(xiàn)障礙，線粒體氧化磷酸化受阻，ATP酶活性顯著下降，ATP合成減少，離子濃度失衡，形成惡性循環(huán)，最后導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[10]。本研究結(jié)果顯示，心肌缺氧復(fù)氧損傷后線粒體ATP酶活性呈現(xiàn)明顯降低趨勢，而PTD4- Cu/ZnSOD融合蛋白干預(yù)后有明顯提升，說明PTD4- Cu/ZnSOD融合蛋白可提高心肌細(xì)胞線粒體ATP酶活性，維持線粒體內(nèi)離子濃度平衡，穩(wěn)定線粒體膜通透性，減輕線粒體水腫，維持線粒體膜電位發(fā)揮心肌保護作用，此與線粒體超微結(jié)構(gòu)及線粒體膜電位檢測結(jié)果保持一致。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化及ATP形成的主要場所，是人體內(nèi)ROS生成的主要部位，同時也是對ROS損傷敏感的細(xì)胞器之一[11]。當(dāng)線粒體受損時，主要表現(xiàn)為線粒體膜通透性明顯增加，膜電位呈現(xiàn)明顯下降趨勢，即線粒體膜電位下降標(biāo)志著線粒體的受損及細(xì)胞凋亡的開始[11]。本研究結(jié)果表明，心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷引起線粒體膜電位明顯降低，而PTD4- Cu/ZnSOD融合蛋白干預(yù)可明顯減輕下降趨勢；在對細(xì)胞凋亡的檢測中，PTD4- Cu/ZnSOD融合蛋白干預(yù)明顯減輕心肌細(xì)胞凋亡情況，說明PTD4- Cu/ZnSOD融合蛋白能有效抑制線粒體膜電位降低，減輕心肌細(xì)胞凋亡情況。

心肌缺氧復(fù)氧損傷時，ROS能主動攻擊細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid，PUFA)，從而引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[12]，反應(yīng)產(chǎn)生的主要物質(zhì)是MDA，因此MDA間接體現(xiàn)心肌細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化程度。機體線粒體內(nèi)的ROS主要是通過SOD清除，以此減少MDA生成，從而保護線粒體不受過氧化損傷。當(dāng)出現(xiàn)缺血再灌注情況時，SOD活性明顯下降，進而引起線粒體形態(tài)功能障礙。因此檢測SOD活性可直觀反映線粒體ROS的清除能力。本研究結(jié)果表明，PTD4- Cu/ZnSOD融合蛋白干預(yù)可明顯提高線粒體SOD活性，降低MDA含量，使心肌線粒體ROS的清除能力提升，發(fā)揮心肌保護作用。

Bcl- 2家族蛋白能極大程度地影響細(xì)胞凋亡，而Bcl- 2蛋白、Bax蛋白是Bcl- 2家族的重要組成部分。Bcl- 2蛋白是一種重要的細(xì)胞存活促進因子，主要通過抑制自由基產(chǎn)生促進細(xì)胞生存[13]。當(dāng)?shù)蛲鲂盘柺艿酱碳ず?，Bax單體能從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)位至線粒體膜，且與Bcl- 2蛋白結(jié)合，最終誘發(fā)細(xì)胞的凋亡[14- 15]。本研究結(jié)果顯示，HRI組、Cu/ZnSOD組、PTD4- Cu/ZnSOD組Bcl- 2蛋白表達(dá)下降明顯，Bax蛋白明顯升高；經(jīng)PTD4- Cu/ZnSOD處理后的細(xì)胞Bcl- 2/Bax比值明顯較高，說明PTD4- Cu/ZnSOD融合蛋白能提升Bcl- 2蛋白表達(dá)水平，降低Bax表達(dá)，以此保護線粒體膜的滲透性，從而起到抗細(xì)胞凋亡的作用。

本研究將PTD4- Cu/ZnSOD融合蛋白作用于受到缺氧復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞，驗證融合蛋白能減輕線粒體形態(tài)及結(jié)構(gòu)的損傷，抑制線粒體膜電位降低，最終達(dá)到減少心肌細(xì)胞凋亡目的。在本研究結(jié)果基礎(chǔ)上，檢測線粒體ATP酶、SOD和MDA含量、Bcl- 2/Bax蛋白的表達(dá)，使上述研究結(jié)果得到了進一步驗證。本實驗結(jié)果表明，PTD4- Cu/ZnSOD融合蛋白通過提高線粒體的ATP酶活性，保持線粒體離子濃度保持平衡；通過提高線粒體SOD活性清除氧自由基，減輕脂質(zhì)過氧化，以此減輕自由基對線粒體造成的損傷；通過提升線粒體膜Bcl- 2蛋白的表達(dá)水平，降低Bax蛋白的表達(dá)水平，抑制心肌細(xì)胞凋亡，進而發(fā)揮對心肌的保護作用。

綜上所述，PTD4- Cu/ZnSOD融合蛋白通過提高線粒體ATP酶活性，維持線粒體離子濃度平衡狀態(tài)，穩(wěn)定線粒體膜電位，從而減輕線粒體損傷；通過提高線粒體的SOD活性，減輕自由基對線粒體造成的損傷；PTD4- Cu/ZnSOD融合蛋白能提升線粒體膜Bcl- 2蛋白的表達(dá)水平，降低Bax蛋白的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌保護作用。