杜 潔，王海英, 焦廣發(fā)，2

(1.河北體育學(xué)院 運動人體科學(xué)系，河北 石家莊 050041；2.河北醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊，050041)

隨著現(xiàn)代社會的快速發(fā)展，存在異?；虿B(tài)攝食行為的人群數(shù)量越來越多，而運動量的大幅減少以及過度運動行為(運動成癮)人群增多的現(xiàn)象也日益顯現(xiàn)，這使成癮行為問題成為世界范圍內(nèi)研究的熱點問題。美味食物可以激活中腦內(nèi)的獎賞機制，使攝食量和攝食次數(shù)增多[1]。當(dāng)這種過度攝食行為轉(zhuǎn)為強迫狀態(tài)或失去控制時即稱為食物成癮[2]。腦內(nèi)獎賞系統(tǒng)失調(diào)可能是攝食異常導(dǎo)致肥胖的機制[3]。根據(jù)精神疾病診斷與統(tǒng)計手冊(The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，DSM)的分類[4]，食物成癮主要指的是BED和神經(jīng)性貪食(bulimia nervosa，BN)兩種類型的攝食行為異常。近年來的研究中建立了以糖、脂高熱量食物為誘導(dǎo)物的食物成癮動物模型[5]。成癮狀態(tài)伴有多種行為異常，但對于食物成癮攝食活動與運動行為之間的關(guān)系和機制尚不清楚。

運動行為主要分為無目的性的自主活動和主動性的運動。自主活動(locomotor activity)是機體除基礎(chǔ)代謝、食物產(chǎn)熱作用外的另一種主要能量支出形式，但是關(guān)于自主活動的調(diào)控機制和其他生理作用研究報道較少[6]，而也有學(xué)者認(rèn)為自主活動是一種與攝食行為相關(guān)聯(lián)的重要補償機制[7]。主動運動(voluntary exercise)是決定長期健康的重要因素，但營養(yǎng)因素可以改變主動運動行為的易感性[8]。大鼠進行主動轉(zhuǎn)輪運動的行為不僅代表身體活動的水平，也是一種環(huán)境與基因相互作用的復(fù)雜行為，代表神經(jīng)系統(tǒng)存在獨立的改變能量平衡活動的機制[9]。

攝食與運動是機體維持能量平衡的基本生理活動，但生理學(xué)和心理學(xué)學(xué)家都認(rèn)識到攝食行為異常與運動行為的改變存在某種聯(lián)系的共病現(xiàn)象(comorbidity)[10]，而對這二者之間的關(guān)聯(lián)機制并不清楚。阿片肽是成癮獎賞機制發(fā)揮作用的關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)，主要由阿黑皮素原(pro-opiomelanocortin，POMC)產(chǎn)生。阿片肽受體在中樞內(nèi)的廣泛分布顯示出這一物質(zhì)參與正常和異常攝食行為[11]。阿片肽受體激動劑DAMGO能促進大鼠產(chǎn)生對糖的喜好[12]。納洛酮(Naloxone, Nal)是阿片肽u受體阻斷劑，具有治療食物成癮的作用[13]。激活或阻斷阿片肽系統(tǒng)均伴有自主活動的改變，而運動成癮現(xiàn)象進一步證實阿片肽也參與了自主運動行為調(diào)控的神經(jīng)內(nèi)分泌活動[14]。因此，POMC的阿片肽系統(tǒng)可能在攝食行為和運動行為之間發(fā)揮著重要關(guān)聯(lián)作用。本研究推測Nal可能會對食物成癮狀態(tài)下運動行為產(chǎn)生影響。本研究主要觀察果糖偏好大鼠注射Nal后攝食行為、自主活動和主動運動行為的變化，探討中樞阿片肽系統(tǒng)在果糖成癮大鼠攝食和運動行為的中樞調(diào)節(jié)機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠，體重200～250g，鼠齡6～8周，購于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證編號：HB-201503002。大鼠單籠喂養(yǎng)，室溫22～24℃，濕度50%，12h光照/12h黑暗周期，開燈時間為上午7時。動物實驗方案符合動物倫理學(xué)規(guī)定(National Research Council, 1996)，并得到河北醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，大鼠隨機分為正常喂養(yǎng)對照組(Control, Con，15只)和果糖偏好模型組(Fructose Preference，F(xiàn)P，15只)。

1.2 果糖偏好模型方案

FP組大鼠下午3-4點限制飲水適應(yīng)3天。每日上午8時禁食后，腹腔注射LiCl(0.15M，1ml/100g 體重)，2h后給予10%果糖溶液30min。下午3-4點限時飲水1h，除誘導(dǎo)期間2.5h外，其他時間自由攝食。連續(xù)誘導(dǎo)7天后再參照Avena，強化方法為大鼠每天不規(guī)律時間給予果糖溶液30min，強化期間自由攝食水[13]。Con組注射生理鹽水，在相應(yīng)的時間段給予水，其他安排與FP組相同。LiCl 購于MP Biomedicals (上海)公司，果糖購于Biotopped公司。

1.3 果糖偏好測試

模型制備結(jié)束后，首先監(jiān)測FP和Con兩組在自由攝食和飲水狀態(tài)下的體重、24h內(nèi)攝食量和飲水量等生理指標(biāo)，測試前3天Con組每天下午給予10%果糖溶液30min，避免大鼠新奇恐懼對測試實驗的影響[15]。

兩瓶法測定FP和Con兩組大鼠果糖溶液偏好，同時給大鼠提供10%果糖溶液和純水各一瓶，測定30min內(nèi)大鼠對果糖溶液和水的攝取量，測試前大鼠禁水12h。24h果糖溶液攝入量測試是測定FP和Con兩組大鼠一個光照/黑暗周期24h的10%果糖溶液攝取量。

1.4 Nal干預(yù)后監(jiān)測

FP組大鼠分別監(jiān)測自由飲水(ad libitum+Water)、腹腔注射生理鹽水自由飲用果糖溶液(Saline+Fructose)、腹腔注射Nal(Sigma, St. Louis; 3mg/kg, i.p.)[13]后自由飲用果糖溶液(Nal+Fructose)三種干預(yù)下的24h代謝活動和主動運動行為。注射時間為早上7：00。三種干預(yù)條件的代謝活動監(jiān)測間隔1d進行，間隔期間大鼠自由攝食、飲水，并在上午10時給予果糖溶液30min。在整個實驗期間大鼠均自由攝食普通飼料。

1.4.1 代謝活動監(jiān)測

大鼠攝食、攝水行為和自主活動采用美國Columbus代謝分析系統(tǒng)(CLAMS; Columbus Instruments)進行監(jiān)測。上午9-10時將大鼠放入代謝籠中，進氣流量2L/min，系統(tǒng)持續(xù)提供飲水和飼料，實時監(jiān)測大鼠自主活動。自主活動是通過大鼠阻斷紅外光線束的次數(shù)表示，指標(biāo)為中斷總次數(shù)和活動的中斷次數(shù)，差值為大鼠重復(fù)動作次數(shù)。系統(tǒng)記錄的重復(fù)動作主要指大鼠的整理活動，這種動作通過監(jiān)測重復(fù)阻斷同一個光束的次數(shù)獲得。

1.4.2 主動運動監(jiān)測

采用自主運行跑輪對大鼠主動運動行為進行監(jiān)測，監(jiān)測前于造模最后三天每天下午訓(xùn)練大鼠在跑輪中活動30min。監(jiān)測時大鼠于上午7：00單籠喂養(yǎng)于具有轉(zhuǎn)輪的籠中，記錄24h跑輪轉(zhuǎn)數(shù)，同時監(jiān)測大鼠攝食食量、攝水或攝果糖溶液量。由于主動運動行為個體差異較大，F(xiàn)P組大鼠主動運動變化以其自身在攝水條件下的運動量為參照，計算比值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(M±SME)表示，并用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，F(xiàn)P組與Con兩組各指標(biāo)比較，以及FP組注射Saline和Nal下主動運動量比較采用獨立樣本t檢驗。FP組自由攝食水，以及注射Saline和Nal干預(yù)果糖喂養(yǎng)狀態(tài)下的攝食量和自主活動次數(shù)比較采用one-way ANOVA檢驗，方差分析后采用Tukey檢驗，F(xiàn)P組的飲水量與注射Saline和Nal后果糖攝入量比較因方差不齊采用Wilcoxon秩和檢驗。統(tǒng)計學(xué)差異為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 果糖偏好BED模型檢驗

大鼠誘導(dǎo)果糖BED模型后，F(xiàn)P組與Con兩組大鼠體重(t(28)=-0.446， p=0.659)、攝食量(t(28)=0.695，p=0.493)和攝水量(t(28)=-1.512，p=0.142)無差異指標(biāo)比較無差異(Table1)。利用雙瓶測試對兩組大鼠進行果糖偏好測試(Fig.1A、B)，結(jié)果顯示FP組大鼠果糖攝入量高于Con組大鼠(t(28)=19.219，p<0.001)，F(xiàn)P組嗜好比顯著高于Con組(t(28)=15.170，p<0.001)，同時FP組大鼠24h果糖攝入量高于Con組(t(28)=13.326，p<0.001)(Fig.1C)。

Table 1. Body weight, food intake and water intake in FP and Con rats after food addiction model procedure

Data represent M±SEM. n=15 per group. Differs from Con *p<0.05, ** p<0.01.

2.2 Nal對果糖偏好BED大鼠攝食活動的影響

FP組大鼠正常飲水量與注射Saline或Nal后24h果糖溶液的攝入量結(jié)果顯示(Z=-3.408，p=0.001)，注射Saline后果糖攝入量高于飲水量(p<0.001)，注射納洛酮后果糖攝入量下降(P<0.001)，但仍高于飲水量(P<0.001)。FP組大鼠24h普通飼料的攝入量(F(2,42)=34.350， p<0.001)果糖喂養(yǎng)狀態(tài)低于飲水狀態(tài)期間(p<0.05)，但注射納洛酮后果糖喂養(yǎng)狀態(tài)下攝食量下降(p<0.001)(Fig.2)。

Fig.1. Two-bottle test(A、B) and 24h-fructose intake test(C)Data represent M±SEM. n=15 per group. Differs from Con *p<0.05, ** p<0.01.

Fig.2. The 10% fructose intake (A) and chow intake (B) for 24h were decreased by Nal in FP rats

2.3 Nal對果糖偏好BED大鼠自主活動和主動運動的影響

FP組大鼠果糖喂養(yǎng)期間24小時水平方向上自主活動的總次數(shù)(F(2,42)=93.151，p<0.001)、位置移動次數(shù)(F(2,42)=54.966，p<0.001)和重復(fù)動作次數(shù)(F(2,42)=211.723，p<0.001)，以及垂直方向自主活動總次數(shù)(F(2,42)=76.78，p<0.001)均高于飲水狀態(tài)下相應(yīng)指標(biāo)(p<0.001)。注射納洛酮后FP組大鼠水平方向和垂直方向自主活動水平均下降(p<0.001)，并且水平方向上的自主活動低于飲水狀態(tài)(p<0.001)(Fig.3)。

Fig.3.The locomotor activity for 24h was decreased by Nal in FP ratsNal: naloxone. Data represent M±SEM. n=15 per group. Differs from ad libitum water *p<0.05, **p<0.01. Differs from I.P saline #p<0.05, ##p<0.01.

由于FP組大鼠自主活動的個體差異和時相性，F(xiàn)ig.4A，B顯示FP組中一只大鼠在不同狀態(tài)下24h內(nèi)不同時間段內(nèi)的變化趨勢。按白天和夜晚分段統(tǒng)計垂直活動(F(2,42)=76.793，p<0.001; F(2,42)=76.777，p<0.001)和水平活動(F(2,42)=94.635，p<0.001；F(2,42)=90.904，p<0.001)狀態(tài)，F(xiàn)P組大鼠在果糖喂養(yǎng)期間24h內(nèi)水平方向和垂直方向自主活動總次數(shù)趨勢白天和夜晚增多高于飲水狀態(tài)(p<0.001)，注射納洛酮后晝夜自主活動水平均下降(p<0.001)(Fig.4C)。

Fig.4.The locomotor activity for light-dark cycle was changed bye Nal of a representative rat in FP group (A,B). The locomotor activity for light cycle and dark cycle was decreased by Nal in FP rats(C)Nal: naloxone. Data represent M±SEM. n=15 per group. Differs from ad libitum water *p<0.05, **p<0.01. Differs from I.P saline #p<0.05, ##p<0.01.

以FP組大鼠飲水狀態(tài)下24h主動運動量為參照，計算出注射納洛酮前后主動運動比值。結(jié)果顯示，注射納洛酮后果糖喂養(yǎng)期間主動運動量增多(t(28)=-14.732，p<0.001)(Fig.5)。

3 討論

本研究中果糖偏好BED模型大鼠在一系列的果糖攝入量測試中表現(xiàn)出明顯的果糖喜好，并且在短時間攝入大量果糖溶液，符合食物成癮動物模型基本標(biāo)準(zhǔn)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，Nal降低果糖BED大鼠果糖溶液和普通飼料的攝入量，同時還表現(xiàn)出自主活動水平的下降和主動運動行為的增強。

Fig.5.The change rate of voluntary exercise for 24h was decreased by Nal in FP rats.

本研究發(fā)現(xiàn)Nal抑制果糖偏好大鼠果糖溶液和食物的攝入，這與多數(shù)研究結(jié)果一致。激活阿片肽系統(tǒng)可快速增加攝食量和次數(shù)[17]，Nal是嗎啡樣物質(zhì)的特異拮抗劑，能競爭性阻止并取代嗎啡樣物質(zhì)與受體結(jié)合，阻斷嗎啡樣物質(zhì)的作用。Nal能夠降低阿片肽信號通路改變攝食偏好行為[18]。大鼠腦內(nèi)注射嗎啡后酒精和攝食量增多，而注射Nal可使酒精攝入量減少，但對攝食和飲水量沒有影響，注射DAMGO后刺激攝食，但對酒精攝入沒有作用[19]。這提示Nal阻斷阿片肽系統(tǒng)能對果糖成癮大鼠獎賞系統(tǒng)產(chǎn)生對食物非選擇性的抑制。

自主活動重復(fù)動作的增多，如搖頭和舔毛，也可以間接反映模型組大鼠存在一定戒斷癥狀，但本研究結(jié)果顯示此癥狀并不典型。垂直方向的自主活動主要代表大鼠站立的次數(shù)，也可以間接反映大鼠吮舔活動的增多。站立活動增多通常反應(yīng)大鼠處于焦慮狀態(tài)，提示本研究模型組大鼠存在類成癮行為的特征。自主活動的變化并不與能量平衡調(diào)節(jié)相一致[20]。肥胖?jǐn)z食增多往往伴有顯著的自主活動減退[21]，而毒品引起的成癮卻表現(xiàn)為自主活動增多[22]。阿片肽受體負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)自主活動的基礎(chǔ)信號水平，并與其他神經(jīng)內(nèi)分泌物質(zhì)一同維持長期的效應(yīng)[23]。阿片肽能神經(jīng)元興奮水平升高導(dǎo)致焦慮行為[24]，而在焦慮狀態(tài)下大鼠的自主活動會增加。嗎啡誘導(dǎo)自主活動增多，另一種阿片肽受體拮抗劑納美芬能在短時間內(nèi)反轉(zhuǎn)自主活動行為[25]。綜合分析，阻斷阿片肽系統(tǒng)獎賞機制后果糖偏好大鼠的自主活動行為有所好轉(zhuǎn)。從行為學(xué)角度分析，果糖偏好大鼠自主活動中重復(fù)動作的變化說明模型大鼠在果糖條件下存在成癮的焦慮狀態(tài)，而Nal降低了果糖成癮大鼠的焦慮水平。

本研究發(fā)現(xiàn)，Nal可以抑制果糖成癮大鼠飲用果糖溶液時的自主活動同時增強自主運動行為。自主運動也表現(xiàn)為自愿進行的主動運動，是一種更為復(fù)雜形式的運動，正常情況下許多種類的動物在沒有獎賞的條件下也具有很強烈的主動運動行為[26]。動物實驗發(fā)現(xiàn)主動轉(zhuǎn)輪運動可以做為獎賞的動機，大鼠能形成通過按壓的行為方式獲得轉(zhuǎn)輪[27]。人類中也發(fā)現(xiàn)存在運動成癮或運動依賴的現(xiàn)象，說明運動與獎賞系統(tǒng)存在復(fù)雜的聯(lián)系[28]。習(xí)慣從事轉(zhuǎn)輪運動的小鼠存在對轉(zhuǎn)輪運動可變的獎賞閾值，實驗發(fā)現(xiàn)使用可卡因可以增加正常小鼠的自主運動行為，但卻降低了過度運動小鼠的運動行為[29]。大鼠主動運動行為的增多會伴有攝食的減少和體重下降，這一現(xiàn)象也被稱為運動性厭食[30]。主動運動與成癮行為在中樞內(nèi)存在重疊的調(diào)控區(qū)域[31]。大鼠進行主動轉(zhuǎn)輪運動降低位置偏好測試嗎啡的獎賞作用[32]，而耐力運動也可以增加內(nèi)源性阿片肽的釋放[33]。綜合本研究實驗結(jié)果，可以推測攝食成癮行為與自主活動和主動運動行為在中樞系統(tǒng)可能存在相互增強或抑制的調(diào)控機制，這是否可以解釋肥胖人群過度攝食但運動行為意愿下降還需要進一步的研究。

4 小結(jié)

阿片肽系統(tǒng)參與果糖偏好大鼠果糖的獎賞效應(yīng)下自主活動增多、主動運動行為抑制的中樞調(diào)節(jié)過程。