杜樂山，劉海燕，翟曉朦，任夢云，李俊生，關 瀟

(中國環(huán)境科學研究院國家環(huán)境保護區(qū)域生態(tài)過程與功能評估重點實驗室，北京 100012)

自工業(yè)革命以來，隨著大量伐木毀林以及化石燃料的燃燒，大氣層中CO2濃度日益增高，已由工業(yè)革命前的280 μmol·mol-1增加到如今的370 μmol·mol-1，并以每年1.8 μmol·mol-1的速度迅速增加[1]。預計到21世紀中期，大氣中的CO2濃度將達到550 μmol·mol-1[2]；到21世紀末，CO2濃度將增至421～936 μmol·mol-1[3]。作為植物光合作用和初級代謝的基本物質(zhì)，CO2濃度升高是全球氣候變化中極少數(shù)對農(nóng)作物生產(chǎn)力有正向因子的作用之一[4]，對植物表型特征、光合作用、生理生化乃至繁殖等均有顯著影響。植物葉片是植物進化過程中對環(huán)境變化較敏感的器官，其解剖結(jié)構(gòu)最能體現(xiàn)環(huán)境因子對植物的影響[5]及植物對環(huán)境的適應策略[6-8]，因此，研究CO2濃度升高對植物葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響尤為重要。

苜蓿(Medicagosativa)是多年生豆科植物，具有適應性強、草質(zhì)優(yōu)良、營養(yǎng)豐富、適口性好等諸多優(yōu)點，被譽為“牧草之王”。秋眠性是苜蓿的重要特性，北美科學家先后根據(jù)秋眠類型將苜蓿劃分為9個和11個等級。秋眠型苜蓿秋季刈割后再生速度慢，產(chǎn)量較低，抗寒性強；非秋眠型苜蓿刈割后再生速度快，產(chǎn)量高，但越冬率低；半秋眠型苜蓿介于二者之間[9]。國內(nèi)外針對不同秋眠類型的苜蓿也開展了大量研究，特別是翟曉朦等[10-13]針對CO2濃度升高對不同秋眠類型苜蓿生長及生理的影響開展了一系列研究，但CO2濃度變化、秋眠類型及生長期對苜蓿葉片解剖結(jié)構(gòu)影響的研究仍十分欠缺。為此，本研究選取具有代表性的3類秋眠級苜蓿(秋眠型、半秋眠型、極非秋眠型)作為試驗材料，采用開頂式生長室(open-top chambers,OTC)模擬大氣CO2濃度增加對苜蓿不同秋眠型、不同生長期葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響及苜蓿對CO2濃度變化的響應，為深入探討氣候變化對植物影響及植物的生態(tài)適應性提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用苜蓿種子由北京林業(yè)大學提供，采用美國標準秋眠性苜蓿對照品種：秋眠型Maverick(簡稱FD1)、半秋眠型ABI 700(簡稱FD6)和極非秋眠型UC 21465(簡稱FD11)，代表3個不同的秋眠類型。

1.2 試驗設計

試驗在中國環(huán)境科學研究院順義試驗站(38°39′27.97″ N，104°04′58.66″ E)進行，該地屬暖溫帶半濕潤氣候，年平均溫度11.2 ℃，年平均降水量為695.4 mm。試驗在全透明的OTC中進行，氣室是由高2.4 m、邊長1.15 m的玻璃組成的八邊形框架結(jié)構(gòu)[12]，保證充足同質(zhì)的自然光照、土壤(V腐殖質(zhì)∶V黃黏土∶V蛭石=1∶1∶1)及水分條件(0-20 cm土層土壤含水量平均值在40%～45%)。試驗模擬當前、21世紀中期和21世紀末的CO2濃度，設置3個CO2濃度梯度，探討不同秋眠型苜蓿在不同生長期葉片解剖結(jié)構(gòu)的變化。試驗組全天通入CO2氣體，通過傳感器控制OTC內(nèi)CO2濃度分別為(550±100) μmol·mol-1(T1)和(700±100) μmol·mol-1(T2)；對照組全天通入自然風，CO2濃度為(350±50) μmol·mol-1(CK)。試驗共設置12個OTC，分為3組；每個OTC放置8個花盆(口徑17 cm，高度12 cm)，花盆的大小、土壤量均保持一致，每花盆種植10株苜蓿。于5月5日播種開始試驗，分別于分枝期(6月9日)、初花期(7月18日)、盛花期(8月19日)和成熟期(9月28日)取樣測定。

1.3 樣品制備與觀察

取相同葉位、成熟健康的新鮮葉片進行清洗，用干紗布擦干，選取0.5 cm×1 cm的小片，采樣后立即置于FAA固定液中固定24 h以上。石蠟切片按常規(guī)方法以酒精脫水-石蠟包埋-切片(厚度8～10 μm)-番紅固綠對染-加拿大樹膠封片的步驟進行[14]。對3個CO2處理(CK、T1、T2)、3種秋眠型(FD1、FD6、FD11)、5個生長期(苗期、分枝期、初花期、盛花期、成熟期)各選10張切片，每一切片選取5個視野，共獲取3×3×5×50=2 250個視野數(shù)據(jù)。

在OLYMPUS光學顯微鏡下，分別測量表皮細胞厚度(epidemiscells thickness,ET)、柵欄組織厚度(palisade parenechyma thickness,PT)、海綿組織厚度(spongy parenchyma thickness,ST)和葉片總厚度(leaf thickness,LT)，并分別計算葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度(cell tense ratio,CTR,%)和葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度(spongy ratio,SR, %)：

CTR=PT/LT×100%;

SR=ST/LT×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

葉片解剖結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)均用平均值±標準差的形式表示。采用Three-way ANOVA分析CO2濃度、秋眠型、生長期及交互效應對葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響。分別計算不同CO2濃度、不同秋眠類型、不同生長期的解剖特征平均值，采用One-way ANOVA分別對CO2處理、秋眠類型和生長期間的差異進行分析，并利用LSD法進行多重比較。采用One-way ANOVA分析同一秋眠型、同一生長期植株在不同CO2濃度下的差異，并利用LSD法進行多重比較。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO2濃度、秋眠型、生長期對葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響

苜蓿解剖結(jié)構(gòu)受CO2濃度、生長期的影響較大，受秋眠類型影響較小(表1)。CO2處理對葉片厚度、表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、組織結(jié)構(gòu)緊密度、組織結(jié)構(gòu)疏松度有顯著影響(P<0.01)或極顯著影響(P<0.001)；秋眠類型僅對海綿組織厚度有顯著影響(P<0.05)；不同生長期對所有葉片解剖結(jié)構(gòu)均有極顯著影響(P<0.001)。葉片解剖結(jié)構(gòu)不僅受單因素的影響，同時也受到多因子共同作用的影響。如CO2處理和生長期的交互效應，對葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度有極顯著影響(P<0.001)，對其他指標影響不大；CO2處理與秋眠類型的交互效應對葉片厚度(P<0.01)、海綿組織厚度有顯著影響(P<0.05)，對其他指標影響不大；生長期與秋眠類型的交互效應和三者的交互效應對葉片厚度、表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、組織結(jié)構(gòu)緊密度有顯著(P<0.01)或極顯著影響(P<0.001)，對SR影響不大。

表1 CO2濃度、秋眠型、生長期對葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響Table 1 Effect of CO2 concentration, fall dormancy and growth stage on leaf anatomical structure

同列不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。FD1、FD6、FD11分別表示秋眠型Maverick、半秋眠型ABI 700和極非秋眠型UC 21465，***,P<0.001, **,P<0.01, *,P<0.05。

Different lowercase letters indicate significant difference among treatments based on One-way ANOVA. FFD1, FD6, FD11indicate Maverick，ABI 700 and UC 21465, respectively. ***,P<0.001, **,P<0.01, *,P<0.05.

2.2 CO2濃度對葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響

隨CO2濃度升高苜蓿葉片平均厚度顯著增厚(P<0.05)，T1、T2較CK分別增加了14.9%、22.1%，且三者間差異均顯著(P<0.05，表1，圖1)。不同秋眠型葉片平均厚度差異不顯著(P>0.05，表1)。葉片平均厚度隨生長期的延遲顯著增厚(P<0.05)，分枝期、初花期、盛花期、成熟期較苗期分別增加了17.4%、31.5%、53.6%、67.1%，且不同生長期之間差異顯著(P<0.05，表1，圖1)。

圖1 不同濃度CO2處理對葉片厚度和表皮厚度的影響Fig. 1 Effect of different CO2 concentrations on leaf and epidermal thickness

不同小寫字母代表同一秋眠型、同一生長期植株在不同CO2濃度處理之間差異顯著(P<0.05)。下同。

Different lowercase letters indicate significant difference among different CO2concentration with the same fall dormancy and growth period; similarly for the following figures.

隨CO2濃度升高苜蓿表皮平均厚度顯著增厚(P<0.05)，T1、T2較CK分別增加了4.0%、8.6%，且三者之間差異均顯著(P<0.05，表1，圖1)。不同秋眠型表皮平均厚度差異不顯著(P>0.05，表1)。表皮平均厚度隨生長期的變化顯著增厚(P<0.05)，分枝期、初花期、盛花期、成熟期較苗期分別增加了8.3%、14.3%、21.3%、26.3%，且不同生長期之間差異顯著(P<0.05，表1，圖1)。

隨CO2濃度升高苜蓿柵欄組織平均厚度顯著增厚(P<0.05)，T1、T2較CK分別增加了17.6%、25.4%，且三者之間差異均顯著(P<0.05，表1，圖2)。不同秋眠型柵欄組織平均厚度差異不顯著(P>0.05，表1)。柵欄組織平均厚度隨生長期的變化顯著增厚(P<0.05)，分枝期、初花期、盛花期、成熟期較苗期分別增加了20.2%、40.1%、64.5%、80.1%，且不同生長期之間差異顯著(P<0.05，表1，圖2)。

隨CO2濃度升高苜蓿海綿組織平均厚度顯著增厚(P<0.05)，T1、T2較CK分別增加了17.8%、25.5%，且三者之間差異均顯著(P<0.05，表1，圖2)。不同秋眠型海綿組織平均厚度差異不顯著(P>0.05，表1)。海綿組織平均厚度隨生長期的變化顯著增厚(P<0.05)，分枝期、初花期、盛花期、成熟期較苗期分別增加了19.7%、31.8%、60.4%、76.6%，且不同生長期之間差異顯著(P<0.05，表1，圖2)。

隨CO2濃度升高組織結(jié)構(gòu)緊密度平均值顯著增大(P<0.05)，T1、T2較CK分別增加了1.9%、2.6%，且T1、T2間差異不顯著，與CK差異顯著(P<0.05，表1，圖3)。不同秋眠型苜蓿組織結(jié)構(gòu)緊密度平均值差異不顯著(P>0.05，表1)。組織結(jié)構(gòu)緊密度平均值隨生長期的變化差異顯著(P<0.05)，分枝期、初花期、盛花期、成熟期較苗期分別增加了2.1%、6.5%、7.1%、7.7%；苗期組織結(jié)構(gòu)緊密度最小，與其他4個生長期差異顯著；成熟期組織結(jié)構(gòu)緊密度最大，僅與苗期、分枝期差異顯著(P<0.05，表1，圖3)。

圖2 不同濃度CO2處理對柵欄和海綿組織厚度的影響Fig. 2 Effect of different CO2 concentrations on palisade and spongy tissue thickness

隨CO2濃度升高組織結(jié)構(gòu)疏松度平均值顯著增大(P<0.05)，T1、T2較CK分別增加了2.23%、2.26%，且T1、T2間差異不顯著，與CK差異顯著(P<0.05，表1，圖3)。不同秋眠型組織結(jié)構(gòu)疏松度平均值差異不顯著(P>0.05，表1)。組織結(jié)構(gòu)疏松度平均值隨生長期的變化顯著(P<0.05)，分枝期、初花期、盛花期、成熟期較苗期分別增加了1.6%、0.3%、4.2%、5.5%；初花期組織結(jié)構(gòu)疏松度均值最小，成熟期組織結(jié)構(gòu)疏松度最大(P<0.05，表1，圖3)。

圖3 不同濃度CO2處理對CTR和SR的影響Fig. 3 Effect of different CO2 concentrations on CTR and SR

3 討論與結(jié)論

植物葉片解剖結(jié)構(gòu)是研究植物對不同生境的結(jié)構(gòu)與功能適應性的重要材料，特別是研究植物對大氣CO2變化的響應具有重要意義。CO2是植物進行光合作用和初級代謝的基本物質(zhì)，CO2加富對植物葉片解剖結(jié)構(gòu)有明顯影響，大量研究表明CO2濃度升高顯著增加了C3植物葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度[14]，該結(jié)論在本研究得到了進一步證實，苜蓿葉片總厚度和各組織厚度均有明顯加厚。柵欄組織應對CO2加富的方式可分為兩種：CO2濃度升高促進植物葉片細胞的分裂，使柵欄組織層數(shù)增加[15-16]；CO2濃度升高使柵欄組織、海綿組織細胞的體積變大，葉片厚度增加[17]。柵欄組織層數(shù)及厚度是衡量植物光合作用強弱的重要指標[18-19]，因為柵欄組織含有大量的葉綠體，其層數(shù)及厚度增加能提高植物葉片對光合和環(huán)境CO2的吸收能力。海綿組織通常由一些排列較疏松、不規(guī)則形細胞組成，胞間隙發(fā)達，主要進行氣體交換[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，高CO2濃度下苜蓿的柵欄組織層數(shù)未發(fā)生變化，但明顯增厚，海綿組織增厚，這是苜蓿葉片應對CO2濃度升高的適應性策略[21]，因為柵欄組織和海綿組織加厚，增加了葉綠體含量和氣體交換速率，進而提高光合作用速率和適合度，該結(jié)論也在翟曉朦等[11]的研究中得到了驗證。

秋眠性是苜蓿的重要特性，由于秋季光照時長變短和氣溫下降，其莖枝出現(xiàn)匍匐生長、生長減緩甚至停止。已有研究發(fā)現(xiàn),光周期[20,22-24]、溫度[25-27]等對不同秋眠類型苜蓿有顯著影響，但本研究不同CO2濃度對苜蓿葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響不大?？赡苁且驗槿~片是對CO2變化最敏感的器官[28]，能夠準確反映出CO2對其產(chǎn)生的直接影響；而秋眠性受光照時長、氣溫的影響較大，受CO2的影響相對較小。

不同功能型植物在同一生長期，葉片解剖結(jié)構(gòu)可能完全不同；同一植物的不同發(fā)育階段，葉片解剖結(jié)構(gòu)也會有所差異[29]。如銀杏(Ginkgobiloba)在展葉期無柵欄組織和海綿組織的分化；展葉后葉肉分化為柵欄組織1～2層，細胞呈長橢球形，海綿組織發(fā)達，細胞呈橫向排列的橢球形；衰老期部分海綿組織細胞變小，并縱向排列，通氣系統(tǒng)發(fā)達[30]。沙芥(Pugioniumcornutum)幼苗期柵欄組織細胞間隙大，海綿組織細胞排列緊密，幾乎沒有細胞間隙；旺盛生長期海綿組織細胞形狀不規(guī)則，具細胞間隙[31]。連香樹(Cercidiphyllumjaponicum)幼葉發(fā)育早期葉肉組織無明顯分化，成熟葉片的柵欄組織細胞在層數(shù)和細胞形態(tài)上與分化初期差異不大，但細胞壁較幼期厚，細胞經(jīng)向有一定伸長[29]。多年生黑麥草(Loliumperenne)在生長旺盛季，葉肉細胞的生長與CO2濃度升高呈正相關關系，而在生長緩慢季，葉片細胞的生長與CO2濃度呈負相關關系[32]。本研究中，苜蓿隨著時間變化，其葉片厚度、柵欄組織、海綿組織均有一定程度加厚，這與其在不同生長發(fā)育階段對生活環(huán)境的適應密切關聯(lián)。因為不同發(fā)育階段的細胞對CO2的傳遞阻力不同[18]，而葉肉組織通過細胞對CO2的傳遞阻力來影響葉片的光合作用[33]，苜蓿葉片各解剖結(jié)構(gòu)的協(xié)同變化提高了葉片本身的光合能力[10]，進而提高整個植物的生物量[11]。

綜上所述，葉片解剖結(jié)構(gòu)受CO2濃度變化、生長期的影響較大，受秋眠類型影響較??；且受三因子交互效應影響顯著。解剖結(jié)構(gòu)厚度隨CO2濃度升高顯著增加(P<0.01)，這有利于增加葉綠體含量和氣體交換速率，進而提高光合作用速率和牧草產(chǎn)量，是苜蓿應對CO2濃度增加的適應性反應；葉片厚度、表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度隨生長期變化顯著增加(P<0.01)，這可能是苜蓿葉片解剖結(jié)構(gòu)協(xié)同變化的結(jié)果；但葉片解剖結(jié)構(gòu)在不同秋眠類型間差異不大(P>0.05)，是因為秋眠性受光照時長、氣溫的影響較大，受CO2的影響相對較小。本研究為預測CO2濃度變化對植物的影響提供了重要的數(shù)據(jù)支撐，但在自然條件下，伴隨CO2濃度升高，土壤肥力、水分及土壤微生物等均會發(fā)生變化，研究解剖結(jié)構(gòu)受多個因子的綜合影響，對準確預測未來氣候變化對植物的影響及植物的適應策略具有重要意義，其中涉及的相互作用機理尚待生理和分子方面的進一步研究。