許利英，周青平，陳仕勇，陳有軍，李亞萍，田莉華

(1.西南民族大學(xué)生命與科學(xué)技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041； 2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041)

中華羊茅(Festucasinensis)是禾本科羊茅屬多年生草本植物，是中國西北、華北、東北和青藏高原等地常見的野生牧草，常生于海拔2 600～4 800 m的高山草甸、山坡草地、灌叢、林下等地。中華羊茅作為高寒牧區(qū)草地生產(chǎn)建設(shè)的優(yōu)良牧草，具有營養(yǎng)價值高、適口性好、再生性和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)。莖稈柔軟，馬、牛、羊都比較喜食，其中在夏、秋、春三季是各類牲畜的主要牧草，易增膘長肉。同時，中華羊茅適應(yīng)性廣，耐寒性和刈割能力強(qiáng)，是高寒牧區(qū)草地建設(shè)、退牧還草和生態(tài)治理工程中最適宜的優(yōu)良牧草品種之一,也是我國青藏高原地區(qū)代表性的優(yōu)良牧草之一[1-3]。因此，開展中華羊茅種質(zhì)資源及其適應(yīng)性的研究對我國高寒牧區(qū)畜牧業(yè)的發(fā)展以及生態(tài)恢復(fù)建設(shè)具有重要意義?厱

目前對中華羊茅的研究多集中在栽培草地建設(shè)、抗逆性及內(nèi)生真菌等方面[4-7]，但關(guān)于其種質(zhì)資源遺傳多樣性方面的研究還未見報道。王康英[4]發(fā)現(xiàn)，在3種鈉鹽(NaCl、NaHCO3、Na2CO3)脅迫下中華羊茅種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均隨著鹽濃度的升高而降低。汪建軍等[5]對溫度和PEG處理對中華羊茅種子萌發(fā)的影響進(jìn)行系統(tǒng)的分析，表明低濃度(-0.2 MPa)的PEG溶液對中華羊茅種子活力具有促進(jìn)作用，高濃度(-0.8 MPa)的PEG溶液則對其種子活力有抑制作用。

目前分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛用于羊茅屬物種的遺傳育種研究，特別是在高羊茅等代表性物種上的相關(guān)研究較多[8-11]。其中SSR標(biāo)記應(yīng)用最為廣泛，其具有重復(fù)性好，結(jié)果可靠性高，操作簡單；多態(tài)性豐富且標(biāo)記數(shù)量多等特點(diǎn)。在植物遺傳育種研究中作為一種主要的分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性分析和系統(tǒng)學(xué)研究[12]。本研究采用EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)對來自青藏高原地區(qū)的24個中華羊茅種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性的評價分析，旨在為中華羊茅野生種質(zhì)的鑒定、保護(hù)及利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

24份中華羊茅樣品分別采集自四川、西藏和青海等青藏高原地區(qū)(表1)，其中23份為野生種質(zhì)資源，1份為登記品種。供試材料種子于2016年12月播種于花盆中，放置在人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)，待其生長到3～4片葉時取樣。

1.2 DNA提取

每份中華羊茅材料選取10～15個單株的葉片混合，采用植物基因組DNA提取試劑盒(DP305，由天根生化科技有限公司提供)提取樣品的DNA，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計(jì)(NANODROP LITE)檢測DNA樣品的純度和濃度。

1.3 引物篩選

選用65對羊茅屬高羊茅的基因組SSR分子標(biāo)記的引物進(jìn)行擴(kuò)增分析[13]。選擇形態(tài)差異大、海拔高差大的4份中華羊茅材料，提取DNA，利用65對高羊茅SSR 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。選用多態(tài)性好、條帶清晰的引物，對全部24份中華羊茅材料進(jìn)行分析。

1.4 PCR擴(kuò)增

SSR 反應(yīng)體系(20 μL)：模板DNA 2 μL (20 ng)，SSR引物 2 μL，2×Es Taq MasterMix(Dye) 10 μL，加ddH2O 6 μL。擴(kuò)增反應(yīng)在JY966 Thermal Cycler型PCR循環(huán)儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃變性30 s,64 ℃退火 30 s,72 ℃ 延伸50 s,25個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min,4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離110 min，電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染并用數(shù)碼相機(jī)照相保存。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，在相同遷移位置上，將穩(wěn)定、清晰的條帶記為1，無帶或不易分辨的弱帶記為0，獲得原始數(shù)據(jù)矩陣。統(tǒng)計(jì)其每對引物總擴(kuò)增條帶和多態(tài)位點(diǎn)、多態(tài)位點(diǎn)百分比(percent of polymorphism bands,PPB)和多態(tài)性信息含量(polymorphic information content,PIC)。在 NTSYS 軟件計(jì)算供試材料間的Dice遺傳相似系數(shù)，并基于Dice遺傳相似系數(shù)進(jìn)行UPGMA聚類分析和主成分分析(principal component analysis,PCA)[14]。采用GenAlEx 6.5計(jì)算供試材料地理距離、海拔與遺傳距離的Mantel相關(guān)性分析[15]。采用POPGENE 1.31計(jì)算不同海拔類群的Nei’s基因多樣性和香農(nóng)指數(shù)(Shannon-Wiener index)[16]。

表1 中華羊茅材料信息Table 1 Data concerning Festuca sinensis

續(xù)表1

序號No.編號Material No.來源地Origin海拔Elevation/m經(jīng)度Longitude(E)緯度 Latitude(N)20I-2-23-7青海格爾木市唐古拉山口Tanggula Mountains, Golmud City, Qinghai5 19791°55'336″32°54'246″2110-66青海曲瑪萊縣曲瑪河鄉(xiāng)Qumahe Township, Qumaleb County, Qinghai4 61793°57'485″35°32'876″2210-52青海曲瑪萊縣曲瑪河鄉(xiāng)Qumahe Township, Qumaleb County, Qinghai4 61793°57'485″35°32'876″2310-121青海德令哈縣柯魯柯鎮(zhèn)Kelukezhen Town, Delingha City, Qinghai2 91297°99'044″37°17'138″24I-2-23-2西藏那曲地區(qū)安多縣Amdo County, Nagqu Prefecture, Tibet5 06791°50'995″31°37'138″

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR多樣性分析

從65對高羊茅SSR引物中共篩選出17對條帶型清晰、多態(tài)性好的引物。利用這些引物，對24份中華羊茅的DNA進(jìn)行擴(kuò)增(表2)。本研究中供試材料的電泳條帶均在100～500 bp(圖 1)。同時不同引物擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)不同，同一引物對24份資源擴(kuò)增的條帶類型和位點(diǎn)數(shù)也不一樣。17對引物在供試的24份資源中共檢測到102個位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)95個，多態(tài)性比率為93.14%,平均每對引物的多態(tài)性位點(diǎn)5.59個。每條引物擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)4～8個，平均每條引物檢測到6個位點(diǎn)，多態(tài)性信息含量指數(shù)PIC值變化為0.240～0.470，平均值為0.381。這也表明篩選的高羊茅SSR標(biāo)記在中華羊茅中具有較好的通用性和高多態(tài)性。

2.2 遺傳關(guān)系分析

本研究中24份中華羊茅種質(zhì)資源間的遺傳相似系數(shù)在0.188～0.675，平均值為0.486。其中I-14-1-1與I-2-23-7之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳相似系數(shù)為0.188；09-124(青海平安)與09-141(青海平安)的親緣關(guān)系最近，遺傳相似系數(shù)為0.675，這都表明了供試的中華羊茅種質(zhì)間具有豐富的遺傳變異。

2.3 聚類分析及主成分分析

根據(jù)各個資源間的Dice遺傳系數(shù)對24份中華羊茅種質(zhì)資源進(jìn)行UPGMA聚類，結(jié)果表明在遺傳距離0.52處可將其分為八大類(圖2)。第Ⅰ類由來自青海的1號(09-099)和來自西藏的9號(09-261)資源2份材料組成。第Ⅱ類包括了5個材料，均來自青海，其中來自青海格爾木的3號(09-141)和來自青海平安的4號(09-124)材料具有非常近的親緣關(guān)系。第Ⅲ類由6份材料組成，包括來自青海的5號、7號、11號、12號和來自西藏的6號，以及來自四川的8號材料組成。第Ⅳ類包括了6份材料，其中3份來自青海，2份來自西藏，四川1份。第Ⅴ類包括2份資源，分別來自青海的23號(10-121)和西藏的24號(I-2-23-2)資源。第Ⅵ類由1份材料組成，是來自青海的10號(10-116)。第Ⅶ類由來自四川的16號(I-14-1-1)材料構(gòu)成。第VIII類由一份材料20號(I-2-23-7)來自青海的構(gòu)成。這兩份材料與其他材料間表現(xiàn)出了較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，在遺傳上表現(xiàn)了一定的特異性。

基于供試材料間遺傳相似系數(shù)進(jìn)行PCA分析,結(jié)果表明第1主成分的變異解釋比率為62.01%,第2主成分變異解釋比率為3.40%，第3主成分變異解釋比率為3.24%,3個主成分累計(jì)解釋的變異比率為68.65%,大體上能夠反映中華羊茅各個資源間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，與聚類的結(jié)果基本保持一致。

2.4 地理分化分析

供試24份材料的遺傳距離與地理距離的mantel檢驗(yàn)結(jié)果表明二者之間相關(guān)性較低且不顯著(r=0.062，P=0.139),這與聚類分析的結(jié)果相一致。海拔與種質(zhì)間的遺傳距離之間的相關(guān)性也較低(r=0.05，P=0.492)。根據(jù)本研究中供試材料的海拔分布，將供試材料分為3個不同的海拔類群，即低海拔組(2 500-3 000 m)、中海拔組(3 000-3 600 m)和高海拔組(4 000-5 000 m)。不同海拔類群的遺傳變異分析顯示(表3)，分布于中度海拔(3 000-3 500 m)的中華羊茅種質(zhì)具有最高的Nei’s基因多樣性(0.304 3)和香農(nóng)多樣性指數(shù)為0.462 2，遺傳變異較高；高海拔地區(qū)(4 000-5 000 m)的種質(zhì)遺傳變異較低，其Nei’s基因多樣性0.249 7,香農(nóng)多樣性指數(shù)為0.395 6;而低海拔類群種質(zhì)(2 500-3 000 m)具有適中的遺傳變異，其Nei’s基因多樣性為0.284 9,香農(nóng)多樣性指數(shù)為0.432 7。

表2 17對引物序列和擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Primer sequences and amplification results

圖1 NFA017引物電泳擴(kuò)增圖Fig. 1 Electrophoresis amplification by primer NFA017

海拔范圍Altitude range/m樣本數(shù)NNei’s基因多樣性 Nei’s gene diversity香農(nóng)指數(shù)Shannon-Wiener index2 500-3 00080.284 90.432 73 000-3 60070.304 30.462 24 000-5 00090.249 70.395 6

3 討論

由于不受環(huán)境影響，不受限于植物的發(fā)育階段，分子標(biāo)記已成為遺傳多樣性評價的強(qiáng)有力的主流研究手段[17-18]，廣泛應(yīng)用于植物遺傳育種的各個方面[19]。在羊茅屬資源中，SSR也已經(jīng)用于遺傳評價、圖譜構(gòu)建、關(guān)聯(lián)分析等工作[18]。Romina等[10]用15條引物檢測161份來自不同國家的高羊茅(Festucaarundinacea),共檢測到214個多態(tài)性基因，平均每條引物檢測到5～24個，遺傳距離變幅范圍為0.627～0.840，體現(xiàn)了較高的遺傳多樣性。Saha等[13]在高羊茅中開發(fā)了152對SSR引物，其中92%的引物能夠擴(kuò)增出條帶。同時，這些標(biāo)記在不同的物種中表現(xiàn)出了不同的多態(tài)性比率。在羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)等異花授粉植物中檢測到66%的多態(tài)性標(biāo)記，而在水稻(Oryzasativa)和小麥(Triticumaestivum)中僅有43%和38%的多態(tài)性標(biāo)記。本研究選用了其中的65對引物在中華羊茅中進(jìn)行擴(kuò)增，最后篩選出了17對效果較好的標(biāo)記。這也表明高羊茅引物在中華羊茅中具有較好的通用性和多態(tài)性，是其資源遺傳評價等有效的SSR標(biāo)記來源。

基于遺傳相似系數(shù)的聚類分析等結(jié)果表明，供試材料的聚類并沒有與其地理來源表現(xiàn)出較高的相關(guān)性，其中西藏、四川的材料與青海的材料間聚類存在交叉。這可能與中華羊茅異花授粉的繁育方式相關(guān)，不同地區(qū)種質(zhì)間存在廣泛的基因流，如來自青海平安的7份材料除了3號(09-141)資源與4號(09-124)資源聚在一類，其他5份資源分別與不同地理來源的資源聚在一類，這與鴨茅(Dactylisglomerata)和多花黑麥草(L.multiflorum)等異花授粉牧草的種質(zhì)資源評價特點(diǎn)表現(xiàn)出了一定的相似性[20-23]。此外，其中16號材料I-14-1-1和20號材料I-2-23-7在形態(tài)學(xué)和生理抗性上也表現(xiàn)出了特異性，與其遺傳特異性相吻合，如16號葉片較為纖細(xì)，對干旱、復(fù)水等處理非常敏感，而20號材料則葉片較寬，莖較粗壯有一定的耐旱性。

通過遺傳距離與地理距離的分析發(fā)現(xiàn)兩者沒有明顯的相關(guān)性，但發(fā)現(xiàn)在海拔梯度呈現(xiàn)一定的遺傳分化。嚴(yán)學(xué)兵等[23]發(fā)現(xiàn)海拔高度對披堿草(Elymusdahuricus)的遺傳進(jìn)化和選擇起著巨大的作用；Chen等[24]對于青藏高原垂穗披堿草(E.nutans)遺傳分化的研究也揭示了中度海拔的材料具有較高的遺傳變異，與本研究結(jié)果相似。本研究中高海拔種質(zhì)具有相對較低的遺傳變異，這與其較高海拔具有相對較惡劣的生態(tài)環(huán)境有關(guān)，也是其資源保護(hù)的重點(diǎn)；而低海拔的遺傳變異較低與人為的過度干擾等因素有關(guān)，中等海拔具有相對較高的遺傳多樣性，這些結(jié)果為中華羊茅種質(zhì)資源的保護(hù)和利用提供了重要的參考。

4 結(jié)論

本研究中采用SSR標(biāo)記對來自青藏高原地區(qū)的24 份中華羊茅種質(zhì)資源的遺傳變異及親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，選用的高羊茅SSR標(biāo)記在中華羊茅中表現(xiàn)出了較好的通用性，結(jié)果揭示了供試材料間具有豐富的遺傳變異，明確了不同地理來源的材料間的遺傳親緣關(guān)系。其中I-14-1-1與其他野生種質(zhì)表現(xiàn)出了較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系；中等海拔3 000-3 600 m類群的材料具有較高的遺傳變異，研究結(jié)果為中華羊茅的資源保護(hù)及利用提供了重要參考。