杜艷影,劉小紅,2,李 勁,李磊明,司友斌* (.農(nóng)田生態(tài)保育與污染防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,安徽 合肥 230036；2.中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 20008)

環(huán)境中Cr主要以Cr(III)和Cr(VI)形式存在,前者低毒[1],且能在中性條件下與氫氧化物生成沉淀而得以去除;而Cr(VI)具有劇毒且易溶于水,容易在水體中遷移轉(zhuǎn)化和生物富集,濃度較高時(shí)能造成人體皮膚潰爛、眼睛刺痛和消化道粘膜損傷等,低濃度時(shí)也會(huì)有致癌、致畸、致突變效應(yīng),對(duì)人類健康和環(huán)境造成嚴(yán)重的影響.Cr(VI)的處理通常采用還原中和、離子交換、鉻酸鋇沉淀等方法[2].近年來(lái),也有報(bào)道利用生物材料吸附法去除水中 Cr(VI)[3].但這些方法都有污染大、難回收、易造成二次污染等特點(diǎn).目前研究發(fā)現(xiàn)許多微生物對(duì) Cr(VI)具有很強(qiáng)的抗性,并能在好氧或厭氧狀態(tài)下將 Cr(VI)轉(zhuǎn)化為毒性較低的 Cr(III)[4].由于細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中不斷進(jìn)行繁殖,因此在代謝活動(dòng)中可不斷將 Cr(VI)還原為 Cr(III),而不會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)飽和現(xiàn)象.另外,生物法設(shè)備簡(jiǎn)單,投資少[5],在 Cr(VI)去除方面值得推廣.微生物還原 Cr(VI)的機(jī)制目前也是研究的熱點(diǎn).

Shewanella oneidensis MR-1屬于革蘭氏陰性兼性厭氧細(xì)菌,適宜生長(zhǎng)溫度30℃,在培養(yǎng)皿中經(jīng)48h培養(yǎng)形成圓形、橘黃色、無(wú)光澤、表面光滑、邊緣規(guī)則的菌落[6].S. oneidensis MR-1屬于典型鐵還原菌,使重金屬還原,從而起到解毒作用[7].而微生物通過(guò)自身的生理活動(dòng)直接將 Cr(VI)還原為 Cr(III),被普遍認(rèn)為是酶促反應(yīng)過(guò)程,即為生物體內(nèi)某些還原酶的還原作用,這些酶通稱為 Cr(VI)還原酶[8].研究發(fā)現(xiàn) S.oneidensis MR-1可在20min內(nèi)將100mmol/L的Cr(VI)還原為 Cr(III),而且鉻酸鹽的增加對(duì)菌體生長(zhǎng)無(wú)影響[9].此外,發(fā)現(xiàn)腐敗希瓦氏菌 S. putrefaciens MR-1[10]、認(rèn)為蒼白桿菌Ochrobactrum sp.[11]都可將Cr(VI)還原為 Cr(III).對(duì)于其還原機(jī)理,研究發(fā)現(xiàn) S.putrefaciens MR-1對(duì)鉻還原后的沉淀在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外都存在,但是未確定沉淀的化學(xué)形態(tài)[12].S.oneidensis MR-1在以甲烷為碳源條件下對(duì)水鐵礦的還原率很低[13].關(guān)于微生物對(duì) Cr(VI)還原的機(jī)理研究一直都頗具爭(zhēng)議.本文主要研究S. oneidensis MR-1對(duì) Cr(VI)還原作用及其影響因素,并且采用 SEMEDS、XPS等方法進(jìn)行表征.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

重鉻酸鉀(K2Cr2O7,純度≥99.8%);鉻儲(chǔ)備液(500mg/L)于4℃冰箱保存;鐵儲(chǔ)備液(100mg/L)于4℃冰箱保存;二苯碳酰二肼、丙酮、硫酸、硫酸亞鐵銨、鹽酸羥胺、鄰菲啰啉、冰醋酸、三氯化鐵、無(wú)水乙醇、鹽酸均為分析純.

菌種來(lái)源:S. oneidensis MR-1由西北農(nóng)林科技大學(xué)土壤微生物實(shí)驗(yàn)室提供.

菌懸液的配制主要采用 LB培養(yǎng)基,后期試驗(yàn)所用培養(yǎng)基為S. oneidensis MR-1專性培養(yǎng)基.

LB富集培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏 5.0,蛋白胨 10.0,NaCl 5.0,pH值調(diào)至7.0左右;固體培養(yǎng)基再按1.5%～2.0%的比例加入瓊脂粉,121℃滅菌30min[7].

S.oneidensis MR-1專性培養(yǎng)基(g/L):KH2PO4·7H2O 3.0、Na2HPO4·7H2O 12.8、NH4Cl 1.0、NaAc 2.0、酵母抽提物2.0[7].

菌懸液的制備:在無(wú)菌條件下,將保存的 S.oneidensis MR-1接種到固體LB培養(yǎng)基中,恒溫30℃培養(yǎng),經(jīng)過(guò)24h培養(yǎng)生長(zhǎng),將S. oneidensis MR-1轉(zhuǎn)移到已滅菌的液體培養(yǎng)基中繼續(xù)恒溫培養(yǎng).在液體 LB培養(yǎng)基中,30℃恒溫振蕩,搖菌轉(zhuǎn)速180r/min,經(jīng)過(guò)24h培養(yǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期.

人工合成 Fe(OH)3的制備方法:稱取 38.07g FeCl3·6H2O 于 1L大燒杯中,加入去離子水 1000mL,攪拌使其溶解,滴加1mol/L NaOH溶液,控制pH值在7.0～7.6之間,可得紅褐色懸浮狀Fe(OH)3即為人工合成的 Fe(OH)3原液.人工合成的 Fe(OH)3具有比表面積大和活性高的特點(diǎn).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將S. oneidensis MR-1菌懸液無(wú)菌操作接種至含有液體S. oneidensis MR-1專性培養(yǎng)基的血清瓶中,并添加 Cr(VI)溶液,充氮?dú)獬?加蓋密封,置于 30℃搖床中 150r/min 振蕩培養(yǎng),定期采集樣品,測(cè)定培養(yǎng)液及細(xì)胞中 Cr(VI)濃度變化.同時(shí)設(shè)置不添加 S.oneidensis MR-1菌懸液作為對(duì)照,每種處理3次重復(fù).

菌株的厭氧培養(yǎng):在超凈厭氧工作臺(tái)上,高純 N2通過(guò)一個(gè)裝有細(xì)菌過(guò)濾器的塑膠管充入裝有培養(yǎng)液的棕色瓶中.充氣15min后,快速擰緊瓶蓋密封后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng).

影響因素的設(shè)置:分別調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基的 Cr(VI)濃度、接菌量,pH值,Fe(OH)3投加量.調(diào)節(jié)Cr(VI)濃度為0,5,10,20,30mg/L;接菌量的設(shè)置是將0.1,0.2,0.4mL S.oneidensis MR-1菌懸液接種至20mg/L的Cr(VI)液體培養(yǎng)基中,溶液總體積為 20mL;控制 pH 值為5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,Fe(OH)3濃度分別設(shè)置投加0,0.5,1,1.5mmol/L Fe(III)(以 Fe(OH)3形式).

樣品提取:樣品搖勻后取3組5mL懸濁液:一組稀釋5倍后用于測(cè)定OD值,并且轉(zhuǎn)換成細(xì)胞數(shù)[14];一組放入10mL離心管以4000r/min離心10min后,測(cè)定六價(jià)鉻的含量;一組用注射器將懸濁液吸出,用孔徑為0.45μm 濾膜過(guò)濾,收集濾液,放入 4℃冰箱保存,用于測(cè)定總鉻.

六價(jià)鉻測(cè)定:本實(shí)驗(yàn)采用二苯碳酰二肼分光光度法測(cè)定Cr(VI)含量.

1.3 掃描電鏡能譜分析(SEM-EDS)

取培養(yǎng)好的S.oneidensis MR-1菌液, 1500r/min離心8min,棄去上清液.分別加入0.1moL/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2),1500r/min離心8min,棄去上清液,重復(fù)兩次.依次進(jìn)行固定、漂洗、脫水、干燥后,取適量菌體粉末置于掃描電鏡(日立S-4800型)樣品臺(tái)上,鍍膜處理后對(duì)樣品進(jìn)行觀察,并用掃描能譜(Model H-7650,Hitachi, Japan)對(duì)菌體進(jìn)行成分分析[15].

1.4 X射線光電子能譜分析(XPS)

高性能 X射線光電子能譜(XPS)[16],儀器型號(hào)為Thermo ESCALAB 250,X射線激發(fā)源為單色Al Ka(hv =1486.6eV),功率 150W,X 射線束斑 500 μm,能量分析器固定透過(guò)能為30eV.

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

Cr(VI)還原率的計(jì)算方法:

式中:ω為 Cr(VI)的還原率,%;C0為初始 Cr(VI)的濃度,mg/L;Ct為T時(shí)刻Cr(VI)的濃度,mg/L.

相關(guān)數(shù)據(jù)分析用Excel和Origin 8.5軟件處理.

2 結(jié)果與討論

2.1 S. oneidensis MR-1的生長(zhǎng)曲線及其對(duì) Cr(VI)的還原

圖1 不同Cr(VI)濃度下S. oneidensis MR-1的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of S. oneidensis MR-1at different concentrations of Cr(VI)

圖2 Cr(VI)初始濃度對(duì)S. oneidensis MR-1還原Cr(VI)的影響Fig.2 Effect of initial Cr(VI) concentration on Cr(VI) reduction by S. oneidensis MR-1

不同 Cr(VI)濃度會(huì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)及活性產(chǎn)生不同的影響,并表現(xiàn)為不同的Cr(VI)還原率.由圖1可見(jiàn),在 30℃、pH 7.0條件下,未添加 Cr(VI)時(shí),S.oneidensis MR-1生長(zhǎng)較快,連續(xù)培養(yǎng)3d后,菌體濃度每 mL高達(dá) 1.2×108個(gè).當(dāng)添加不同濃度 Cr(VI)后,S.oneidensis MR-1的生長(zhǎng)受到一定程度的抑制,其菌體濃度增長(zhǎng)呈現(xiàn)不同程度的降低.隨著 Cr(VI)濃度的增大,Cr(VI)對(duì)菌株的毒性越強(qiáng),當(dāng)Cr(VI)濃度為30mg/L時(shí),在培養(yǎng) 3d后菌體濃度每 mL僅為 2.01×107個(gè),表明Cr(VI)濃度越高,對(duì)S. oneidensis MR-1生長(zhǎng)的抑制越強(qiáng).從圖2可知,Cr(VI)還原率隨著Cr(VI)初始濃度增大而顯著減小.Cr(VI)初始濃度為 5mg/L的處理組,Cr(VI)去除率在1d內(nèi)便達(dá)到了95%,當(dāng)Cr(VI)初始濃度為20mg/L,Cr(VI)還原率在18h內(nèi)只達(dá)到25%,7d才達(dá)到88%.研究結(jié)果表明,初始Cr(VI)濃度對(duì)Cr(VI)還原率影響較大,Cr(VI)初始濃度在 20mg/L及以下時(shí),Cr(VI)還原率隨反應(yīng)時(shí)間增加較快,且最終基本可達(dá)到 100%;當(dāng) Cr(VI)初始濃度在 30mg/L,Cr(VI)還原率增加緩慢.由圖2可知,在相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi),Cr(VI)還原量隨 Cr(VI)初始濃度增大而呈減少趨勢(shì).隨著反應(yīng)進(jìn)行,單位時(shí)間內(nèi)Cr(VI)的去除量逐漸減少.這是因?yàn)?隨著 Cr(VI)初始濃度的增加,細(xì)胞受較高濃度 Cr(VI)毒性影響而降低了活性并減弱了還原能力,最終抑制了Cr(VI)的還原[9].

2.2 S. oneidensis MR-1接種量對(duì)Cr(VI)還原的影響

在其他條件不變的情況下,改變微生物接種量,研究S. oneidensis MR-1接種量對(duì)Cr(VI)還原的影響.從圖3中可以看出,隨著接種量的增加,Cr(VI)還原率也逐漸增大.當(dāng)微生物接種量為 0.5×107、1×107、2×107CFU/mL時(shí),Cr(VI)還原率在第 1d分別達(dá)到15%、25%和40%,在第7d分別達(dá)到80%、88%和100%;當(dāng)接種量為2%時(shí),20mg/L Cr(VI)還原率在第7d可以達(dá)到 100%.微生物在 Cr(VI)還原過(guò)程中具有十分重要的作用,增加接種量有利于Cr(VI)的生物還原.

圖3 接種量對(duì)S. oneidensis MR-1還原Cr(VI)的影響Fig.3 Effect of microbial inoculation density on Cr(VI)reduction by S. oneidensis MR-1

2.3 初始pH值對(duì)S. oneidensis MR-1還原Cr(VI)的影響

初始 pH 值分別為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,Cr(VI)濃度為20mg/L,在S. oneidensis MR-1作用下,Cr(VI)還原曲線如圖4所示.從圖4可以看出,S. oneidensis MR-1還原Cr(VI)的最適pH值為7.0,此時(shí)Cr(VI)還原率在第7d就達(dá)到了88%,pH值為5.0時(shí)Cr(VI)還原率最小,7d時(shí)只有 48%.而偏酸偏堿都會(huì)影響微生物對(duì)Cr(VI)的還原.pH為5.0時(shí)Cr(VI)還原率最小,pH 9.0時(shí)的Cr(VI)還原率高于pH 5.0.在弱堿性環(huán)境中多數(shù)菌體生長(zhǎng)較好,而弱酸性環(huán)境中很多細(xì)菌也能生長(zhǎng),但細(xì)菌在弱堿性環(huán)境中的生長(zhǎng)狀況好于弱酸性環(huán)境[17].在 Cr(VI)的微生物還原過(guò)程中,酶起到主導(dǎo)作用,合適的pH值環(huán)境有利于酶活性的提高.

圖4 初始pH值對(duì)S. oneidensis MR-1還原Cr(VI)的影響Fig.4 Effect of initial pH on Cr(VI) reduction by S. oneidensis MR-1

2.4 Fe(III)濃度對(duì)Cr(VI)還原的影響

微生物可以通過(guò)代謝產(chǎn)物間接還原 Cr(VI),例如Fe(III)還原菌可以將Fe(III)還原為Fe(II),再利用Fe(II)與 Cr(VI)反應(yīng),將 Cr(VI)轉(zhuǎn)化為低毒性和低遷移性的Cr(III),從而達(dá)到去除 Cr(VI)的目的[18].為考察 Fe(III)投加量對(duì) Fe(III)-微生物體系還原 Cr(VI)的影響,分別設(shè)置投加 0,0.5,1,1.5mmol/L Fe(III)(以 Fe(OH)3形式)的處理組,進(jìn)行S. oneidensis MR-1還原Cr(VI)試驗(yàn),結(jié)果如圖5.

從圖中可以看出,投加了 Fe(III)的實(shí)驗(yàn)組均取得了較好的Cr(VI)還原效果,Cr(VI)還原率在7d內(nèi)均達(dá)到 100%.而隨著 Fe(Ⅲ)投加量的增加,Cr(VI)還原率雖仍有所增大,但增幅有限.由此可知,超過(guò)一定的濃度范圍,Fe(III)投加量對(duì) Cr(VI)還原的影響不明顯.試驗(yàn)中,沒(méi)有投加Fe(III)的處理,在第7d時(shí)Cr(VI)的還原率只達(dá)到了88%.

Fe(III)-微生物體系中 Cr(VI)的還原,微生物可通過(guò)直接還原和間接還原兩種方式作用于Cr(VI)[19].未投加 Fe(III)時(shí),微生物通過(guò)酶促反應(yīng)直接還原Cr(VI),還原速率較慢.投加 Fe(III)后,微生物可以較快地將 Fe(III)還原,同時(shí)生成的 Fe(II)可以與 Cr(VI)快速反應(yīng),將Cr(VI)還原為Cr(III),而Fe(II)自身被氧化為 Fe(III),可以重新參與氧化還原反應(yīng).這在一定程度上,也可以解釋 Fe(III)投加量增加時(shí),Cr(VI)還原率增幅不大,是由于 Fe(Ⅲ)可以重復(fù)循環(huán)使用,即使投加較少量的 Fe(III)也足以較快地完成全部Cr(VI)的還原.

圖5 不同濃度Fe(OH)3對(duì)S. oneidensis MR-1還原Cr(VI)的影響Fig.5 Effects of different Fe(OH)3 concentration on Cr(VI)reduction by S. oneidensis MR-1

2.5 S. oneidensis MR-1吸附Cr(VI)的掃描電鏡及能譜分析

圖6 S. oneidensis MR-1吸附Cr(VI)的掃面電鏡能譜圖Fig.6 The SEM and EDS spectrum for S. oneidensis MR-1exposure to Cr(VI)

通過(guò)掃描電鏡(SEM)-能譜(EDS)實(shí)驗(yàn),對(duì)菌體表面形態(tài)和 Cr(VI)吸附進(jìn)行觀察.王娟等[20]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,S. oneidensis MR-1在純培養(yǎng)48h后菌體呈圓形、橘黃色、無(wú)光澤、表面光滑、邊緣規(guī)則.而本實(shí)驗(yàn)掃描電鏡能譜結(jié)果顯示,添加Cr (VI)處理后的實(shí)驗(yàn)組,菌體形態(tài)有了一定的變化,并在菌體表面有 Cr的吸收峰出現(xiàn).這說(shuō)明菌體在對(duì) Cr(VI)進(jìn)行還原的過(guò)程中首先對(duì)Cr進(jìn)行吸附作用.

2.6 S. oneidensis MR-1還原Cr(VI)的X射線光電子能譜分析

活體微生物可以直接還原Cr(VI),將Cr(VI)還原為Cr(III).為分析微生物體系Cr(VI)還原的產(chǎn)物,以及菌體表面及內(nèi)部Cr的形態(tài)特征,本研究采用高性能X射線光電子能譜儀對(duì)S. oneidensis MR-1還原Cr的形態(tài)進(jìn)行表征[21-22].

圖7為微生物體系Cr(VI)還原后,菌體中Cr形態(tài)的XPS全譜圖.圖中明顯出現(xiàn)C、N、O、Cr元素的俄歇譜線,以及Cr2p、C1s、O1S和N1s軌道的特征峰.隨著菌體暴露的Cr(VI)初始濃度增加,特征峰強(qiáng)也在增加.由圖8所示,Cr2p3/2軌道和Cr2p1/2軌道分別在結(jié)合能576～579eV和586～589eV處有明顯出峰.根據(jù)XPS標(biāo)準(zhǔn)能譜手冊(cè)可知,Cr2p3/2軌道處的出峰由Cr(VI)在(578.0±0.1)eV 處 的 出 峰 和 Cr(III)在(576.6±0.1)eV處的出峰疊加而成[23].根據(jù)Cr2p3/2軌道中峰面積計(jì)算分析,當(dāng)初始濃度為 5mg/L時(shí),Cr(III)/Cr(VI)在菌體表面的比率是1.4:1.此外,Cr2p3/2軌道的兩個(gè)峰值表示在微生物還原過(guò)程中有沉淀物 Cr2O3或 Cr(OH)3形成[24].Cr2p1/2軌道處的出峰由 Cr(VI)在(588.1±0.1)eV 處的出峰和 Cr(III)在(586.6±0.1)eV 處的出峰疊加而成,其結(jié)合能比 Cr2p3/2高 10.1eV.由此可知,菌體表面 Cr元素有 Cr(VI)和 Cr(III)兩種價(jià)態(tài).由于各價(jià)態(tài)對(duì)應(yīng)峰面積大小不一致,且 Cr(VI)在(588.1±0.1)eV 處的峰面積最小,而其他部分峰相當(dāng),所以菌體表面 Cr(III)的含量高于 Cr(VI)的含量.研究結(jié)果表明,菌體表面還原反應(yīng)起到主要作用,并伴隨少量的吸附作用.這與湯潔等[16]的結(jié)論一致.

圖7 S. oneidensis MR-1還原Cr(VI)的XPS全譜Fig.7 XPS spectrum for S. oneidensis MR-1exposure to Cr(VI)

圖8 S. oneidensis MR-1還原Cr(VI)的Cr2p軌道峰Fig.8 XPS spectra of Cr2p for S. oneidensis MR-1exposure to Cr(VI)

3 結(jié)論

3.1 Cr(VI)濃度對(duì)S. oneidensis MR-1菌株生長(zhǎng)有一定的影響,隨著Cr(VI)濃度的升高,菌株生長(zhǎng)量明顯減少.高濃度Cr(VI)降低了S. oneidensis MR-1的Cr(VI)還原率,Cr(VI)可以通過(guò)制約菌株生長(zhǎng)與活性來(lái)抑制Cr(VI)還原.

3.2 S. oneidensis MR-1對(duì)Cr(VI)的還原作用隨著接種菌懸液量的增加而增強(qiáng);菌株最適生長(zhǎng)pH值為中性,弱堿性環(huán)境比酸性環(huán)境更有利于菌株對(duì) Cr(VI)的還原;增加Fe(III)的量會(huì)加快Cr(VI)被還原的速率.

3.3 掃描電鏡能譜分析顯示,Cr(VI)被吸附在 S.oneidensis MR-1菌體表面;而高性能X射線光電子能譜分析表明,在S. oneidensis MR-1菌體表面,Cr(VI)被還原成Cr(III).