盧金霞，何 芳，馮 峰，管翠萍，劉軍紅，周學章

(1 寧夏大學 西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021；2 西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 712100)

奶牛乳房炎又稱奶牛乳腺炎(Bovine mastitis)，是奶牛乳腺受物理、化學、微生物刺激所發(fā)生的一種炎癥變化，是一種復雜的乳腺綜合癥，包括乳腺感染、乳腺炎癥、乳房微循環(huán)和免疫障礙等[1-2]，多發(fā)生于產(chǎn)后哺乳期，?？梢鹉膛．a(chǎn)奶量和奶品質(zhì)急劇下降甚至失去泌乳能力。在乳腺免疫防御體系中，奶牛乳腺上皮細胞(Bovine mammary epithelial cells,BMECs)具有哨兵作用，其能夠及時識別病原菌并釋放細胞因子，趨化、激活及調(diào)節(jié)免疫細胞，進而發(fā)揮免疫防御功能[3]。隨著人們對食品安全要求的不斷提高和國家對乳制品品質(zhì)更嚴格的要求，臨床治療乳房炎常用的抗生素由于存在藥物殘留將逐漸被限用或禁用。應用中藥治療奶牛乳房炎，已日益為國內(nèi)外專家所關(guān)注。

苦參堿(Matrine)是豆科植物苦參(SophoraflaescensAit.)的主要有效成分，也存在于苦豆子(S.alopecuroidesL.)、廣豆根(S.subprostrataChun et T.Chen)中?？鄥A具有多種生理學活性，具有消炎抗菌、抗過敏、抗心率失常等作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿能顯著降低慢性肝炎患者血清中透明質(zhì)酸、Ⅳ型膠原蛋白和層粘連蛋白的含量，提示苦參堿具有抗炎及抑制肝纖維化的作用[5]。據(jù)報道，主要成分由丹參、茜草、苦參提取物組成的復方茜草灌注液對臨床型乳房炎的療效優(yōu)于抗生素(青霉素鈉+鏈霉素+生理鹽水)[6]。但有關(guān)苦參堿對體外培養(yǎng)的BMECs增殖、凋亡及抗氧化能力影響的研究未見報道。為此，本試驗對此進行探討，為研制苦參堿制劑及其在奶牛乳房炎防治中的應用提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細 胞 BMECs由本實驗室通過組織塊培養(yǎng)法分離鑒定所得。

1.1.2 試劑與儀器 (1)試劑?？鄥A(純度99.22%)、二甲基亞砜(DMSO)，購自Solarbio公司；胎牛血清，購自Gibco公司；雙抗、DMEM/F12培養(yǎng)基，購自HyClone公司；氫化可的松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、孕酮，均購自Sigma公司；RNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司； 一氧化氮(NO)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒、過氧化氫酶(CAT)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、AnnexinV/PI雙染細胞凋亡試劑盒、四甲基偶氮唑鹽(MTT)法細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒，均購于南京凱基生物發(fā)展有限公司。

(2)儀器。SW-CJ-1F潔凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，HF90CO2恒溫培養(yǎng)箱(上海力申科學儀器有限公司)，AE2000倒置相差顯微鏡(Motic公司)，TDL-40B離心機(上海安亭科學儀器公司)，CyFlow Cube流式細胞儀(德國Partec公司)，680酶標儀和IQ5熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)，Nanodrop2000超微量分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 苦參堿對BMECs增殖的影響

按1.0×104孔-1的量將BMECs接種到96孔板，分為A、B、C、D和E 5組，每組3個重復，分別用含0，25，50，75和100 μg/mL苦參堿的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，于培養(yǎng)的第3，4，5天，棄去培養(yǎng)液，在每孔中加入50 μL 1×MTT，37 ℃孵育4 h后棄去液體，加入DMSO 150 μL/孔，平板搖床搖勻后，用酶標儀于490 nm下測定吸光度(D490 nm)。

1.3 苦參堿對BMECs完整性和泌乳能力的影響

按7.0×104孔-1的量將BMECs接種到12孔板，分組和處理方法同1.2，于培養(yǎng)的第5天，分別用NO試劑盒、LDH測試盒測定細胞培養(yǎng)上清液中NO與LDH含量。

1.4 苦參堿對BMECs凋亡的影響

按1×106孔-1的量將BMECs接種到6孔板，分組和處理方法同1.2，于培養(yǎng)的第5天，采用流式細胞儀(AnnexinV/PI雙染法)測算細胞凋亡率。

1.5 苦參堿對BMECs抗氧化能力的影響

按7.0×104孔-1的量將BMECs接種到12孔板，分組和處理方法同1.2，于培養(yǎng)的第5天，用相應試劑盒測定CAT、GSH-Px、SOD活性及MDA含量。

1.6 苦參堿對BMECs中p53、STAT1、Caspase-3和SOCS3基因mRNA表達水平的影響

以β-actin為內(nèi)參基因，采用real-time PCR法檢測苦參堿對奶牛乳腺上皮細胞p53、STAT1、Caspase-3、SOCS3基因mRNA表達水平的影響。參考文獻[7]設(shè)計p53、STAT1、Caspase-3、SOCS3、β-actin基因的real-time PCR引物，引物序列見表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 p53、STAT1、Caspase-3和SOCS3的引物序列及產(chǎn)物長度Table 1 Primers and product lengths of p53,STAT1,Caspase-3 and SOCS3 gene

按1.0×106孔-1將BMECs接種到6孔板，處理方法同1.2，培養(yǎng)5 d后，嚴格按照天根總RNA提取試劑盒的說明提取細胞總RNA，使用Nano Drop儀器測定總RNA濃度和純度后，采用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA合成。嚴格按照Takara試劑盒說明書，配制20 μL real-time PCR反應體系：SYBR預混合試劑Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus) 2×10 μL，10 μmol/L PCR正向引物0.8 μL，10 μmol/L PCR反向引物0.8 μL，cDNA模板2 μL，滅菌蒸餾水6.4 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s；65 ℃延伸15 s，共40個循環(huán)。反應在伯樂iQ5 real-time PCR System實時PCR檢測系統(tǒng)上進行。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用Excel對試驗數(shù)據(jù)進行預處理，結(jié)果以“平均值±標準差”表示；采用SPSS 17.0單因素方差分析(ANOVA)法對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。基因相對表達量采用2-ΔΔCt方法進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦參堿對BMECs增殖的影響

由圖1可知，培養(yǎng)第3天，B～E組BMECs的增殖水平均低于A組，其中C、D、E組與A組差異極顯著(P<0.01)；培養(yǎng)第4天，B、C、D、E組BMECs細胞增殖水平與A組相比無顯著性差異；培養(yǎng)第5天，B、C組細胞增殖水平高于A組，其中B組與A組差異極顯著(P<0.01)，D、E組細胞增殖水平略低于A組，說明低質(zhì)量濃度(25和50 μg/mL)苦參堿對細胞增殖具有促進作用，而高質(zhì)量濃度(75和100 μg/mL)苦參堿對細胞增殖具有抑制作用。

2.2 苦參堿對BMECs完整性和泌乳能力的影響

LDH是機體能量代謝過程中的重要酶，能催化乳酸脫氫生成丙酮酸，一般存在于細胞漿內(nèi)，細胞膜受損時則會溢出胞外至培養(yǎng)上清中[8]。由圖2可知，B～E組BMECs上清液中NO水平均高于A組，其中C組極顯著高于A組(P<0.01)，表明苦參堿可以提高BMECs的泌乳性能；B、C、D和E組BMECs細胞上清液中的LDH水平均比A組的高，其中B、D組極顯著升高(P<0.01)，C組顯著升高(P<0.05)，說明苦參堿對細胞的完整性有一定的破壞作用。

2.3 苦參堿對BMECs凋亡率的影響

由圖3可知，不同劑量的苦參堿作用于BMECs后，對細胞的凋亡率有不同程度的影響，B、C、D、E組BMECs的凋亡率均極顯著高于A組(P<0.01)，其中B組細胞凋亡率最高。

與A組比較，*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同Compared to group A,* indicates significant difference (P<0.05) and ** indicates extremely significant difference (P<0.01).The same below圖1 苦參堿對BMECs增殖的影響Fig.1 Effects of matrine on proliferation of BMECs

圖2 苦參堿對BMECs培養(yǎng)上清液中NO和LDH含量的影響Fig.2 Effects of matrine on NO and LDH contents in culture supernatant of BMECs

2.4 苦參堿對BMECs抗氧化能力的影響

由圖4可知，B、C、D、E組BMECs的CAT活性均較A組高，其中C組極顯著升高(P<0.01)；B、C、D、E組的GSH-Px活性均極顯著高于A組(P<0.01)；除C組外，B、D和E組的SOD活性隨著苦參堿質(zhì)量濃度增加而明顯升高，其中E組極顯著升高(P<0.01)；B、C和D組的MDA含量較A組下降。綜上可知，苦參堿可提高BMECs的抗氧化能力。

圖4 苦參堿對奶牛乳腺上皮細胞抗氧化能力的影響Fig.4 Effects of matrine on antioxidant ability of BMECs

2.5 苦參堿對BMECs中p53、Caspase-3、SOCS3和STAT1基因mRNA表達的影響

由圖5可知，B～E組的Caspase-3基因相對表達量均高于A組，其中B、D、E組極顯著高于A組(P<0.01)；B、C、D組的p53基因相對表達量極顯著高于A組(P<0.01)，而E組略低于A組；苦參堿對各組細胞的STAT1基因相對表達量無顯著影響；B、C、D和E組的SOCS3基因相對表達量均極顯著高于A組(P<0.01)。上述結(jié)果說明，苦參堿可上調(diào)Caspase-3、p53和SOCS3基因的表達量。

圖5 苦參堿對BMECs中Caspase-3、p53、STAT1和SOCS3基因mRNA表達量的影響Fig.5 Effects of matrine on expressions of Caspase-3,p53,STAT1 and SOCS3 mRNA of BMECs

3 討 論

BMECs是奶牛機體與外界直接接觸的細胞，作為乳腺防御病原菌入侵的第一道防線，其數(shù)量大大超過其他參與抵御入侵病原菌的免疫細胞，在免疫防御過程中具有十分重要的作用。細胞增殖和凋亡間的動態(tài)平衡是維持機體穩(wěn)態(tài)的一個重要方式[9]。本試驗結(jié)果表明，苦參堿作用于BMECs第5天時，低劑量(25和50 μg/mL)藥物既可促進細胞增殖又可促進細胞凋亡，高劑量(75和100 μg/mL)苦參堿可抑制細胞增殖而促進細胞凋亡?？鄥A在低劑量時既可促進細胞增殖又可促進細胞凋亡，原因可能為在此質(zhì)量濃度下，苦參堿對細胞增殖的影響強于苦參堿對細胞凋亡的影響，綜合表現(xiàn)為苦參堿促進細胞增殖；而在高質(zhì)量濃度時，苦參堿既可抑制細胞增殖又可促進細胞凋亡，綜合表現(xiàn)為抑制細胞增殖。隨著泌乳期的改變，乳腺中NO的含量會發(fā)生變化，其含量在泌乳前期與妊娠后期達到最大，可見NO對促進泌乳具有重要作用[7]。在本試驗中苦參堿提高了細胞的NO含量，表明其可以提高BMECs的泌乳性能。

在機體氧化反應過程中會產(chǎn)生具有傳遞能量等作用的自由基，但是機體內(nèi)的自由基應在合適的范圍內(nèi)，過多或者過少都會對機體產(chǎn)生損害。這些自由基具有強氧化作用，會對機體在組織水平、細胞水平或分子水平產(chǎn)生損傷與破壞，最終導致疾病與衰老的發(fā)生[10]。GSH-Px、CAT與SOD是生物機體內(nèi)重要的抗氧化酶，在清除自由基、H2O2和過氧化物以及減少羥基自由基形成等方面發(fā)揮著非常重要的作用[11-12]。MDA是自由基對不飽和脂肪酸引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物，其含量的多少間接反映了細胞內(nèi)自由基的量。因此，通過測定機體SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量，在一定程度上可以反映機體的抗氧化能力[13]。本研究結(jié)果顯示，苦參堿可提高BMECs的SOD、CAT、GSH-Px活性，降低MDA含量，表明苦參堿可提高細胞的抗氧化能力。

Zhang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿對人紅白血病K562細胞的增殖抑制呈量-效關(guān)系和時-效關(guān)系，當苦參堿質(zhì)量濃度為200 μg/mL且作用于細胞3 d后，細胞增殖速度明顯減緩；當苦參堿質(zhì)量濃度小于200 μg/mL時，對人紅白血病K562細胞增殖無明顯抑制作用；當苦參堿質(zhì)量濃度大于200 μg/mL且作用2 d時，細胞增殖受到明顯抑制，并表現(xiàn)出較強的殺傷力。周喜漢等[15]發(fā)現(xiàn)，500～2 000 μg/mL的苦參堿對結(jié)腸癌SW1116細胞的增殖具有顯著抑制作用。本試驗發(fā)現(xiàn)，25～100 μg/mL苦參堿作用3 d時，BMECs的增殖受到抑制；25～50 μg/mL苦參堿作用5 d時，可促進細胞的增殖，但當質(zhì)量濃度在75～100 μg/mL時可抑制細胞的增殖，且與苦參堿質(zhì)量濃度呈負相關(guān)。綜上所述，在進行體外試驗時，不同質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的苦參堿對不同細胞作用不同，提示在臨床上治療奶牛乳房炎時應選擇合適的苦參堿質(zhì)量濃度，即選擇既能促進正常細胞增殖，又可誘導病變細胞凋亡的苦參堿質(zhì)量濃度。

凋亡是一個蛋白酶級聯(lián)反應過程。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族是介導此過程的重要成分，其可分為執(zhí)行者(包括Caspase-3、6、7)和啟動者(包括Caspase-8、9、10)，其中Caspase-3、6、7具有直接降解胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白從而引起凋亡的作用，但是它們不可通過自催化或自剪接的方式激活；而Caspase-8、9、10在接受到信號刺激后能通過自剪接而激活，從而引起Caspase級聯(lián)反應[16-17]。Caspase-3是調(diào)控細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，細胞凋亡的最后通路均與Caspase-3的活化有關(guān)[18]。p53調(diào)控一些僅有BH3區(qū)域的蛋白，誘導細胞凋亡的功能十分顯著[19-20]。p53與STAT1在生物體內(nèi)對于細胞周期與細胞凋亡有重要作用，且都能抑制細胞的癌變[7]。細胞因子信號傳導抑制蛋白-3(SOCS3)具有負調(diào)節(jié)多種細胞因子和激素(包括LIF、IL-11、生長激素、胰島素和瘦素)產(chǎn)生的信號傳導過程的作用，這些信號傳導過程的作用就涉及到了控制炎癥過程、調(diào)節(jié)生長發(fā)育等方面[21]。已有研究證實，SOCS3可以抑制LPS、LIF、IL-2、IL-3、IL-4、IFN-γ和IFN-α產(chǎn)生的信號傳導通路[22]。總體而言，SOCS3具有抑制和阻斷信號傳導通路的作用。在本試驗中，苦參堿上調(diào)了Caspase-3、p53、SOCS3的表達，表明其可促進細胞凋亡，減輕炎癥反應。