張斯穎， 駱焱平，胡 堅，韓丹丹，王蘭英

(海南大學 熱帶農(nóng)林學院，海南 海口 570228)

植物病害是影響農(nóng)作物產(chǎn)出的重要因子之一，每年都會造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。鑒于化學防治帶來的負面影響，生物防治優(yōu)勢日益凸顯[2-3]。植物內(nèi)生細菌不僅可產(chǎn)生新的抑菌活性物質(zhì)、防病機制多樣，而且具有內(nèi)生聯(lián)合固氮、促生等作用，是當今生物防治研究中被關(guān)注較多的領(lǐng)域。金巖等[4]對五味子中的內(nèi)生細菌進行研究發(fā)現(xiàn)，部分內(nèi)生細菌對五味子、番茄等病原真菌有較強的抑菌活性，具有開發(fā)為生防菌的潛能；林玲等[5]從棉花根部分離得到87株對棉花病原真菌具有拮抗活性的內(nèi)生細菌，發(fā)現(xiàn)這些菌株分布于7個屬，具備不同的生防作用機制；李悅等[6]對分離自煙草的解淀粉芽孢桿菌和熒光假單胞桿菌進行研究發(fā)現(xiàn)，這2株內(nèi)生細菌的胞外代謝產(chǎn)物及揮發(fā)性代謝產(chǎn)物能抑制煙草灰霉病菌菌絲的生長，引發(fā)菌絲畸形，有望開發(fā)為復(fù)合微生物制劑。由此可見，從植物內(nèi)生細菌資源中挖掘生防微生物切實可行。但在以往的研究中，關(guān)于能夠廣譜抑制熱帶植物病害的內(nèi)生細菌報道相對較少。YXG2-3是本課題組前期從陰香根部分離篩選獲得的1株內(nèi)生細菌，該菌株對香蕉枯萎病原菌盆栽防效可達63.8%[7]。本研究擬采用平板對峙法、菌絲干重法和孢子萌發(fā)法，測定YXG2-3對多種熱帶病原真菌的抑菌活性，采用浸果法測定菌株發(fā)酵液濾液對香蕉炭疽病的防效，確定菌株分類地位，優(yōu)化其生長條件，以期明確該菌株的生防價值及適宜的生長條件，為其開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

內(nèi)生細菌YXG2-3，從陰香根內(nèi)部分離得到；靶標菌包括橡膠基腐病菌(Fusariumvenfricosum)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.)4號生理小種、香蕉炭疽病菌(Colletotrichummusae)、芒果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporiordes)、橡膠炭疽病菌(Colletotrichumacutatum)、芒果蒂腐病菌(Botryodiplodiatheobromae)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)、橡膠黑團孢病菌(Periconiaheveae)、橡膠落葉棒孢霉病菌(Corynesporacassiicola)、椰子灰斑病菌(Pestalotiapalmarum)，由海南大學熱帶農(nóng)林學院農(nóng)藥實驗室提供。

供試香蕉品種為粉蕉(Musaparadisiaca)，果實采自海南大學熱帶農(nóng)林學院實驗基地；試驗對照藥劑為45%咪鮮胺乳油，由美國富美實公司生產(chǎn)。

1.2 方 法

1.2.1 YXG2-3皿內(nèi)拮抗作用的測定 將供試內(nèi)生細菌YXG2-3接種在NA斜面上，8 ℃培養(yǎng)24 h后備用；靶標菌接種在PDA平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后備用。采用對峙劃線法，用直徑5 mm的打孔器在靶標菌菌落邊緣打取菌餅，將菌餅接種于PDA平板中央；再用接種環(huán)挑取YXG2-3，于距PDA平板中央2 cm處左右兩邊各劃一條直線，每個處理重復(fù)3次，以不接內(nèi)生細菌為對照。將接種后的平板置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5 d，計算內(nèi)生細菌的抑菌率。

抑菌率=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑-5.0)×100%[8]。

1.2.2 YXG2-3發(fā)酵液濾液對靶標菌孢子萌發(fā)的影響 將供試內(nèi)生細菌YXG2-3接入LB培養(yǎng)液，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，取出后5 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm細菌過濾器過濾，收集濾液備用。將靶標菌(因皿內(nèi)測定芒果蒂腐病菌抑菌效果不理想，水稻紋枯病菌不產(chǎn)生無性孢子，故未測定這2種病菌，下述試驗同)接種在PDA平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后，參照文獻[9]制備孢子懸浮液。將發(fā)酵液濾液與孢子懸浮液混合均勻，取1滴滴加在凹玻片上，以過濾的LB培養(yǎng)液替代YXG2-3發(fā)酵液濾液作為對照，每處理重復(fù)3次，25 ℃保溫保濕培養(yǎng)，待對照孢子萌發(fā)率達到85%時，統(tǒng)計各處理的孢子萌發(fā)率，計算孢子萌發(fā)抑制率。

孢子萌發(fā)率=(萌發(fā)孢子數(shù)/檢查孢子總數(shù))×100%；

孢子萌發(fā)抑制率=(對照組孢子萌發(fā)率-處理組孢子萌發(fā)率)/對照組孢子萌發(fā)率×100%[10]。

1.2.3 YXG2-3對靶標菌菌絲生長量的影響 將供試靶標菌接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，用無菌水制成1×106CFU/mL孢子懸浮液備用；將YXG2-3接入LB培養(yǎng)液，28 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)18 h，用分光光度計于630 nm下測定其吸光度(D630 nm)，并用LB培養(yǎng)液稀釋至D630 nm為1.0左右，作為種子培養(yǎng)液備用。配制馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)培養(yǎng)液，裝入150 mL三角瓶中，每瓶裝樣量為54 mL，準確稱取5個玻璃珠，記錄數(shù)據(jù)后將玻璃珠放入三角瓶中；然后分別加入3 mL靶標菌孢子懸浮液和YXG2-3種子培養(yǎng)液，以加入相同體積LB替代YXG2-3種子培養(yǎng)液作為對照，每個處理重復(fù)3次。25 ℃、150 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)6 d，培養(yǎng)物用烘至恒質(zhì)量的濾紙過濾，將濾紙、菌絲及玻璃珠一起在烘箱中于60 ℃烘至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量后，按公式計算菌絲干質(zhì)量及抑菌率。

菌絲干質(zhì)量=總干質(zhì)量-濾紙干質(zhì)量-玻璃珠質(zhì)量；

抑菌率=(對照組菌絲干質(zhì)量-處理組菌絲干質(zhì)量)/對照組菌絲干質(zhì)量×100%[11]。

1.2.4 YXG2-3對香蕉炭疽病防效的測定 采用浸果法測定YXG2-3對香蕉炭疽病的防效[12]。采集八成熟的香蕉果實，落梳后去花器及傷病果，每梳保留5個果，用清水清洗后在室內(nèi)陰干，備用。按照1.2.2中方法制備內(nèi)生細菌YXG2-3發(fā)酵液濾液，將陰干后的香蕉果實浸泡在YXG2-3發(fā)酵液濾液中2 min，室溫陰干，作為內(nèi)生細菌處理；以250 μg/mL 咪鮮胺水溶液處理為藥劑對照，以無菌水處理為空白對照。所有處理果實均用厚度0.04 mm的聚乙烯袋分別密封包裝后放入紙箱，置于溫度為25 ℃、相對濕度為78%的儲藏室存放。果實成熟時進行各處理病情調(diào)查。病情分級標準[13]如下：0 級，果實無病斑；1 級，病斑占果皮面積的 10%以下；3 級，病斑占果皮面積的 11%～25%；5 級，病斑占果皮面積的 26%～50%；7 級，病斑占果皮面積的 51%～75%；9 級，病斑占果皮面積的 76%以上。按下式計算病情指數(shù)和防效。

病情指數(shù)=∑(各級病果數(shù)×相對級數(shù)值)/(調(diào)查總果數(shù)×9)×100；

防效=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%。

1.2.5 YXG2-3菌株的鑒定 (1)形態(tài)特征及生理生化特性。參照文獻[14-15]的方法進行細菌培養(yǎng)特征、菌株形態(tài)特征以及生理生化特性的鑒定。

(2)16S rDNA序列分析。按照全式金基因組DNA提取試劑盒說明書操作步驟，提取YXG2-3基因組DNA。采用細菌16S rDNA通用引物7F(5′-CAGATTTGATCCTGGCT-3′)、1540R(5′-AGG-AGGTGATCCAGCCGCA-3′)，對獲得的菌株總DNA進行PCR擴增。PCR擴增體系為：DNA模板0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，Taq酶0.2 μL，上游及下游引物各0.5 μL，用雙蒸水補足至25 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸20 min。PCR產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序，獲得的序列提交至GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行注冊，并對序列進行Blast分析，用MEGA6.0鄰接(Neighbor-Joining)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。

1.2.6 YXG2-3生長條件的優(yōu)化 (1)碳源、氮源的優(yōu)化。以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，使含碳質(zhì)量分數(shù)相同，分別以葡萄糖5 g/L、麥芽糖5 g/L、蔗糖4.75 g/L、果糖5 g/L、甘露糖5 g/L為外加碳源， LB培養(yǎng)液為對照，進行菌株生長最適碳源優(yōu)化；使含氮質(zhì)量分數(shù)相同，分別以KNO33.25 g/L、 (NH4)2SO44.25 g/L、牛肉浸膏3.46 g/L替代LB培養(yǎng)液中的酵母粉，以LB培養(yǎng)液為對照，進行菌株生長最適氮源優(yōu)化。

將配制的碳、氮源優(yōu)化培養(yǎng)液分別分裝至50 mL三角瓶中，裝樣量為18 mL。滅菌后培養(yǎng)液接入種子培養(yǎng)液(制備方法同1.2.3)2 mL，28 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)18 h，用分光光度計測定其D630 nm值，每個處理重復(fù)3次。

(2)最適pH的確定。以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液pH分別調(diào)至5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，分裝至50 mL三角瓶中，裝樣量為18 mL。滅菌后用1 mol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH，接入種子培養(yǎng)液2 mL，培養(yǎng)條件和檢測方法同上，每個處理重復(fù)3次。

(3)最適培養(yǎng)溫度的確定。以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，分裝至50 mL三角瓶中，裝樣量為18 mL。滅菌后接種種子培養(yǎng)液2 mL，分別置于23，28，33，38，43 ℃培養(yǎng)，其他培養(yǎng)條件及檢測方法同上。每個處理重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法對數(shù)據(jù)進行差異顯著性多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 YXG2-3對10種靶標菌的皿內(nèi)拮抗作用

菌株YXG2-3對10種病原真菌皿內(nèi)拮抗活性的測定結(jié)果(表1)顯示，該菌株對香蕉炭疽病菌的抑菌活性最好，抑菌率可達79.88%；對水稻紋枯病菌的抑菌活性也較高，抑菌率大于70%；該菌株對其余供試靶標菌的抑菌率均在50%以上?？梢娫摼晁置诘囊志钚晕镔|(zhì)較為多樣，抑菌譜廣。

表1 菌株YXG2-3對10種靶標菌的皿內(nèi)抑菌活性Table 1 Antibacterial activities of strain YXG2-3 against 10 targets %

注：同列數(shù)據(jù)后標不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著，標不同大寫字母表示在P<0.01水平差異顯著。下表同。

Note:Different lowercase letters indicate significant difference atP<0.05 level,and different capital letters indicate extremely significant difference atP<0.01 level.The same below.

2.2 YXG2-3發(fā)酵液濾液對靶標菌孢子萌發(fā)的影響

YXG2-3發(fā)酵液濾液對8種植物病原真菌孢子萌發(fā)影響的測定結(jié)果(表2)顯示， YXG2-3發(fā)酵液濾液對供試靶標菌孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用，但效果不理想，抑制率均小于50%。

表2 YXG2-3發(fā)酵液濾液對靶標菌孢子萌發(fā)的影響Table 2 Effect of YXG2-3 fermentation broth on spore germination of targets %

2.3 YXG2-3對靶標菌菌絲生長量的影響

YXG2-3對供試靶標菌菌絲生長量影響的測定結(jié)果(表3)表明，供試8種靶標菌中，YXG2-3對香蕉枯萎病菌的抑制效果最好，抑菌率為81.33%；對香蕉炭疽病菌的抑菌活性次之，抑菌率為74.45%；除橡膠黑團孢病菌外，對其余幾種靶標菌的抑菌率均在60%以上。

表3 YXG2-3對靶標菌菌絲生長量的影響Table 3 Effect of YXG2-3 on mycelial growth of targets %

2.4 YXG2-3對香蕉炭疽病的防效

YXG2-3對香蕉炭疽病防效的測定結(jié)果(表4)顯示，香蕉果實貯藏18 d后基本成熟，且各處理均有發(fā)病，其中無菌水對照組病情指數(shù)達86.66，YXG2-3發(fā)酵液濾液處理組與藥劑對照組病情指數(shù)均小于30；YXG2-3發(fā)酵液濾液對香蕉炭疽病的防效為66.22%，略低于藥劑對照組的70.40%,二者差異不顯著(P>0.05)。

表4 YXG2-3對香蕉炭疽病的防治效果Table 4 Control effect of YXG2-3 against Colletotrichum musae

2.5 YXG2-3菌株的鑒定

2.5.1 形態(tài)特征及生理生化特性 YXG2-3經(jīng)NA平板培養(yǎng)24 h后，肉眼可見菌落較小，圓形，表面光滑凸起，邊緣整齊。顯微鏡下可觀察到該菌株菌體呈桿狀，革蘭氏陰性，無芽孢，運動，鞭毛數(shù)根、極生。生理生化特性測定結(jié)果(表5)表明，YXG2-3接觸酶陽性,氧化酶陽性,V.P反應(yīng)陰性；能使明膠液化，但不能水解淀粉；不能將苯丙氨酸氧化脫氨；能利用檸檬酸鹽生長，能從蔗糖合成果聚糖；能進行反硝化反應(yīng)；可以利用丙二酸鹽，產(chǎn)堿；可以利用葡萄糖、海藻糖、蔗糖、麥芽糖等作為唯一碳源進行生長；41 ℃下不能生長；當 NaCl 質(zhì)量分數(shù)大于 2% 時，生長被抑制；能在KB培養(yǎng)基上產(chǎn)生熒光色素。經(jīng)鑒定認為，該菌生理生化特性與熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)的生理生化特征完全相同。

表5 YXG2-3的生理生化特征鑒定Table 5 Physiological and biochemical characteristics of YXG2-3

注：+陽性，-陰性。

Note:+Positive;-Negative.

2.5.2 16S rDNA序列鑒定 菌株YXG2-3 16S rDNA堿基序列全長1 497 bp，將此序列在GenBank中注冊，獲得登錄號為KT996106。運用在線Blast軟件進行分析發(fā)現(xiàn)，同源性較高的參考菌株多數(shù)為假單胞桿菌屬菌株，選取其中5株同源性高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，發(fā)現(xiàn)菌株YXG2-3與熒光假單胞桿菌P.fluorescens(AY538263)在系統(tǒng)發(fā)育樹同一分支上，二者同源性達99%以上，結(jié)合該菌株的生理生化特征初步推斷，YXG2-3為熒光假單胞桿菌。

圖1 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株YXG2-3的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain YXG2-3 based on 16S rDNA sequence

2.6 YXG2-3生長條件的優(yōu)化

2.6.1 碳源和氮源的優(yōu)化 將YXG2-3接種于含有外加碳源的LB培養(yǎng)液中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，測定其D630 nm，結(jié)果(表6)發(fā)現(xiàn)，外加碳源均能促進菌株生長，且以麥芽糖效果最好，與其他處理差異極顯著；將供試菌株YXG2-3接種于不同氮源的LB培養(yǎng)液中，各處理菌株生長量均顯著低于氮源為酵母粉的對照。

表6 不同碳源和氮源對YXG2-3生長量的影響Table 6 Effects of different carbon sources and nitrogen sources on YXG2-3 growth

2.6.2 最適pH 將供試菌株YXG2-3接種于不同pH的LB培養(yǎng)液中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn),pH對菌株生長量的影響較大，pH為5.0時菌株D630 nm值僅為0.036；隨著pH增加，菌株生長量迅速增大，當pH為7.0時菌株生長量達最高值，D630 nm為2.265，顯著高于其他pH處理(P<0.05)；當培養(yǎng)液呈堿性時，菌株生長量開始下降，可見該菌株適宜生長的pH為中性。

2.6.3 最適培養(yǎng)溫度 將供試菌株接種到LB培養(yǎng)液中，分別于23，28,33，38和43 ℃及180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)18 h，測定其D630 nm值，結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)不同溫度下菌株生長量不同，隨著溫度升高，菌株生長量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在測定溫度范圍內(nèi)，33 ℃時菌株生長量達最大值，隨著溫度進一步升高，菌株生長量迅速降低，溫度達到43 ℃時菌株不能生長。

圖中不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著。下圖同Different lowercase letters indicate significant difference at P<0.05.The same below圖2 pH對YXG2-3生長量的影響Fig.2 Effects of pH on YXG2-3 growth

3 討 論

本研究表明，內(nèi)生菌YXG2-3為熒光假單胞桿菌，雖然熒光假單胞桿菌已經(jīng)在世界范圍內(nèi)得到大量關(guān)注[17-19]，但將其應(yīng)用于防治熱帶病害的報道較少。而YXG2-3不僅對土傳病害香蕉枯萎病有很好的防效[7]，對采后病害香蕉炭疽病也有突出的防治作用。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，YXG2-3適宜生長溫度為33 ℃左右，適合在pH中性環(huán)境中生長，該生長條件與香蕉種植環(huán)境相符[20]，因此該菌株有望應(yīng)用于香蕉病害的防治。另外也有研究報道，熒光假單胞桿菌具有繁殖快、競爭定殖能力強等優(yōu)點，是目前污水處理、微生物肥料生產(chǎn)應(yīng)用中最常見、最重要的細菌菌種之一[21-24]?？梢?，今后可開展YXG2-3在香蕉植株根際定殖能力及對香蕉植株促生能力的研究。

有人認為，熒光假單胞桿菌作為生防菌的優(yōu)勢在于其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物種類多樣[25]。本研究對其進行抗菌譜測定發(fā)現(xiàn)，菌株YXG2-3對鐮刀菌屬(橡膠基腐病菌、香蕉枯萎病菌)、立枯絲核菌屬(水稻紋枯病菌)、炭疽菌屬(香蕉炭疽病菌、芒果炭疽病菌、橡膠炭疽病菌)、黑團孢屬(橡膠黑團孢病菌)、棒孢屬(橡膠落葉棒孢霉病菌)、擬盤多毛孢屬(椰子灰斑病菌)、球二孢屬(芒果蒂腐病菌)7個屬的10種靶標菌的抑菌率均大于50%，說明該菌株抑菌譜較廣，證實了“熒光假單胞桿菌分泌的活性物質(zhì)較為多樣”這一觀點。同時，本研究結(jié)果顯示，YXG2-3可以有效控制靶標菌菌絲增長，但其發(fā)酵液濾液不能有效抑制靶標菌孢子萌發(fā)，分析原因可能是該菌株產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物主要對靶標菌的生物合成有明顯抑制作用，而對生物氧化影響作用較小[26]。因此今后可對其抑菌活性成分進行分離純化，以深入研究其抑菌機理。

4 結(jié) 論

YXG2-3對香蕉炭疽病菌等10種熱帶病原真菌皿內(nèi)抑菌活性很強，與靶標真菌共培養(yǎng)時能夠很好地抑制供試靶標菌菌絲質(zhì)量的增加。其發(fā)酵液濾液對靶標菌孢子萌發(fā)影響不大，但能有效防治香蕉炭疽病害，防效與對照藥劑咪鮮胺(250 μg/mL)相當。經(jīng)鑒定該菌株為熒光假單胞桿菌，適宜的碳、氮源分別為麥芽糖和酵母膏，pH中性環(huán)境最有利于其生長，培養(yǎng)溫度33 ℃左右較為適宜。