李志遠(yuǎn)，于海龍，方智遠(yuǎn)，楊麗梅，劉玉梅，莊木，呂紅豪，張揚(yáng)勇

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

0 引言

【研究意義】結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleraceaL. var.capitata）簡(jiǎn)稱甘藍(lán)，在中國(guó)各地廣泛栽培。截止至2015年，中國(guó)審（鑒、認(rèn)）定或登記的甘藍(lán)品種共計(jì) 247個(gè)[1-5]，其中大部分為一代雜種。近年來，市場(chǎng)上的甘藍(lán)品種不斷增多，種植面積不斷增大。但是，在種子市場(chǎng)上同名異物及同物異名的情況時(shí)有發(fā)生，甚至一些不合格種子混入市場(chǎng)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對(duì)品種進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定，對(duì)于假種辨別和產(chǎn)權(quán)糾紛具有重要作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】早期的品種鑒定手段主要依賴于形態(tài)學(xué)鑒定，這種方法耗時(shí)較長(zhǎng)且易受環(huán)境影響。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)為品種鑒定提供了新的手段。分子標(biāo)記技術(shù)具有周期短、不受環(huán)境條件影響、可進(jìn)行高通量測(cè)試分析等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在品種鑒定、種子純度鑒定等方面得到廣泛應(yīng)用[6-7]。隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，陸續(xù)有基于RFLP、AFLP、SSR、SNP等分子標(biāo)記用于DNA指紋圖譜的構(gòu)建。其中，SNP分子標(biāo)記是國(guó)際植物新品種權(quán)保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）BMT分子測(cè)試指南中構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的推薦標(biāo)記之一[8]。相對(duì)于傳統(tǒng)標(biāo)記，利用SNP標(biāo)記構(gòu)建的指紋圖譜具有數(shù)量多、分布廣泛、穩(wěn)定性高、易于快速且高通量分型的特點(diǎn)[9-10]。分子標(biāo)記技術(shù)在甘藍(lán)品種指紋圖譜構(gòu)建中得到了廣泛的應(yīng)用，薄天岳等[11]通過SRAP、RAPD 2種分子標(biāo)記方法，構(gòu)建了甘藍(lán)品種‘爭(zhēng)春’、 ‘寒光2號(hào)’及其各自親本的DNA指紋圖譜，并將其用于種子純度鑒定。宋順華等[12]利用AFLP標(biāo)記對(duì)來自全國(guó)的44份甘藍(lán)品種進(jìn)行分析，并構(gòu)建了其指紋圖譜。陳琛等[13]利用5對(duì)SSR標(biāo)記構(gòu)建了6個(gè)秋甘藍(lán)品種及其親本共18份材料的指紋圖譜。王慶彪等[5]利用20對(duì)SSR標(biāo)記構(gòu)建50份中國(guó)甘藍(lán)代表品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫并闡述了甘藍(lán)SSR-DNA指紋鑒定的應(yīng)用和技術(shù)流程?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，甘藍(lán)品種鑒定中常用的指紋圖譜是基于AFLP、SSR等分子標(biāo)記。但是，傳統(tǒng)AFLP、SSR指紋圖譜存在標(biāo)記數(shù)量有限、檢測(cè)位點(diǎn)少，位點(diǎn)的突變率高、對(duì)變異反應(yīng)比較敏感等缺點(diǎn)。SNP標(biāo)記作為第三代分子標(biāo)記，具有數(shù)量多、分布廣泛、二態(tài)性、易于快速且高通量的進(jìn)行基因分型等優(yōu)點(diǎn)。SNP標(biāo)記已經(jīng)在玉米[14]、油菜[15]、香菇[16]等作物指紋圖譜構(gòu)建中得到應(yīng)用，但在甘藍(lán)類蔬菜中尚未有基于 SNP標(biāo)記的指紋圖譜?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究基于甘藍(lán)高代自交系的重測(cè)序數(shù)據(jù)開發(fā)SNP標(biāo)記，利用KASP技術(shù)對(duì)主要甘藍(lán)品種進(jìn)行基因分型[17]，根據(jù)分型結(jié)果篩選篩選在染色體上均勻分布、多態(tài)性信息較高的SNP位點(diǎn)作為核心標(biāo)記，并利用核心SNP標(biāo)記構(gòu)建甘藍(lán)品種指紋圖譜，為甘藍(lán)品種真實(shí)性、特異性鑒定提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2016年12月至2017年5月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所甘藍(lán)遺傳育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

指紋圖譜構(gòu)建：從國(guó)內(nèi)主要育種單位搜集（鑒定、登記）市場(chǎng)上推廣的主要代表品種59個(gè)（電子附表1）。

核心SNP標(biāo)記驗(yàn)證：在上述59個(gè)主要甘藍(lán)品種中挑選15個(gè)已推廣的品種，及5個(gè)未推廣的新組合。每個(gè)品種或組合取3粒種子，將種子混合構(gòu)成人工虛擬混合群體。

1.2 DNA提取

將59個(gè)主要代表品種的種子放于培養(yǎng)皿中，采用紙上發(fā)芽，放置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中，催芽5—6 d。取子葉和下胚軸，每份樣品中取若干個(gè)體，共計(jì)0.5 g，采用改良 CTAB法[18]提取 DNA，使用冷凍干燥機(jī)將樣品DNA抽干后置于-80℃保存。

將人工虛擬混合群體種子混合催芽，然后按單個(gè)幼苗提取DNA。

1.3 KASP標(biāo)記開發(fā)及檢測(cè)

對(duì)50個(gè)甘藍(lán)高代自交系進(jìn)行重測(cè)序，所測(cè)的自交系涵蓋了不同茬口（春、秋、越冬）、不同熟性（早、中、晚）及不同球型（扁、圓、尖）的材料，具有很好的代表性。利用重測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組（02-12）[19]進(jìn)行比對(duì)，開發(fā)SNP位點(diǎn)。對(duì)獲得的SNP位點(diǎn)按以下條件進(jìn)行篩選：（1）位點(diǎn)的未測(cè)通材料數(shù)＜20；（2）多態(tài)性在40%—60%；（3）在染色體中均勻分布；（4）位點(diǎn)前后各50 bp不存在其他變異。對(duì)于篩選獲得的SNP位點(diǎn)，截取其前后各50 bp序列，交由LGC公司開發(fā)設(shè)計(jì)KASP引物。

PCR反應(yīng)體系（10.14 μL）為KASP Master mix 5 μL、KASP Primer mix 0.14 μL和模板DNA（20 ng·μL-1）5 μL。PCR反應(yīng)條件為第一輪94℃ 15 min；94℃20 s，61—55℃ 60 s，10個(gè)Touch Down循環(huán)（每個(gè)循環(huán)降低0.6℃）；第二輪94℃ 20 s，55℃ 60 s，26個(gè)循環(huán)。使用熒光微孔板檢測(cè)儀檢測(cè) PCR產(chǎn)物，用LGC公司開發(fā)的SNPviewer軟件讀取檢測(cè)數(shù)據(jù)。所用KASP Master mix 購(gòu)自英國(guó) LGC公司，貨號(hào)為KBS-1016-012。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)分型結(jié)果計(jì)算出各個(gè)標(biāo)記的等位基因頻率，然后利用軟件PIC_Calc 0.6計(jì)算各標(biāo)記的多態(tài)性信息含量（polymorphism information content，PIC），計(jì)算公式為PIC = 1-∑fi2，其中fi為i位點(diǎn)基因頻率。依據(jù)SNP標(biāo)記具有的二態(tài)性特點(diǎn)，將分型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為二元編碼數(shù)據(jù)，將野生型（與參考基因組一致）表示為（1，0），突變體表示為（0，1），將雜合基因型表示為（1，1），缺失堿基位點(diǎn)記為（999，999），對(duì)每份材料進(jìn)行基因型統(tǒng)計(jì)，利用NTSYSpc2.1軟件進(jìn)行相似系數(shù)計(jì)算及基于UPGMA算法的聚類分析[15]。

1.5 核心SNP位點(diǎn)的挑選及其在品種鑒定中的應(yīng)用

根據(jù)基因分型結(jié)果，篩選出多態(tài)性信息含量＞0.35、無基因型數(shù)據(jù)缺失、在9條染色體上均勻分布的SNP位點(diǎn)作為構(gòu)建甘藍(lán)品種指紋圖譜的核心位點(diǎn)。

利用核心SNP標(biāo)記位點(diǎn)，對(duì)人工構(gòu)建的虛擬混合群體進(jìn)行SNP標(biāo)記分析，并與已有SNP-DNA指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，判定虛擬混合群體的60個(gè)樣品的分型結(jié)果是否與指紋圖譜數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)品種對(duì)應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 甘藍(lán)SNP標(biāo)記的開發(fā)

對(duì)50個(gè)甘藍(lán)高代自交系進(jìn)行重測(cè)序，平均測(cè)序深度為5×。將重測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組02-12進(jìn)行比對(duì)，共獲得SNP位點(diǎn)2.54×106個(gè)。篩選位點(diǎn)多態(tài)性介于40%—60%、未測(cè)通材料數(shù)＜20的SNP位點(diǎn)，共獲得2.59×104個(gè)。進(jìn)一步篩選在9條染色體上均勻分布、位點(diǎn)前后各50 bp不存在其他變異位點(diǎn)的SNP位點(diǎn)，最終獲得500個(gè)SNP位點(diǎn)用于下一步試驗(yàn)，平均每條染色體上55.6個(gè)。500個(gè)SNP位點(diǎn)中有442個(gè)成功轉(zhuǎn)化為KASP標(biāo)記，轉(zhuǎn)化成功率為88.4%。

利用KASP平臺(tái)對(duì)59個(gè)甘藍(lán)品種進(jìn)行基因型檢測(cè)，442個(gè)KASP標(biāo)記全部成功分型。在442個(gè)標(biāo)記中，有25個(gè)標(biāo)記的未分型材料數(shù)＞5，為保證結(jié)果準(zhǔn)確性，在后續(xù)分析中將這25個(gè)標(biāo)記去除。在59個(gè)甘藍(lán)品種中，全部標(biāo)記的雜合位點(diǎn)比例大于30%的品種有57個(gè)，占所有品種的96.6%（圖1）。其中，品種‘豫生早熟牛心’的雜合位點(diǎn)比例最高，為 67.8%；‘秦甘78’雜合位點(diǎn)比例最低，為18.8%。所有SNP標(biāo)記在全部品種中多態(tài)性信息含量（PIC）處于 0.12—0.38，PIC值大于0.35的位點(diǎn)占所有位點(diǎn)的63.5%，其中PIC值為0.37的位點(diǎn)最多，有157個(gè)（圖2）。

2.2 核心SNP位點(diǎn)的挑選及DNA指紋圖譜的構(gòu)建

綜合考慮基因分型結(jié)果，篩選PIC值大于0.35、無基因型數(shù)據(jù)缺失、在9條染色體上均勻分布的SNP位點(diǎn)作為構(gòu)建甘藍(lán)品種指紋圖譜的核心位點(diǎn)，最終獲得50個(gè)SNP位點(diǎn)用以構(gòu)建主要品種的指紋圖譜（表1）。50個(gè)核心SNP位點(diǎn)中，位點(diǎn)Bol2-56的PIC值最高，為0.38；位點(diǎn)Bol8-11的PIC值最低，為0.35；平均PIC值為0.36，表現(xiàn)為中度多態(tài)性。

將59個(gè)主要品種的核心位點(diǎn)分型結(jié)果轉(zhuǎn)化為二元編碼數(shù)據(jù)，得到主要甘藍(lán)品種的指紋圖譜（表2）。參考甘藍(lán)SSR-DNA指紋鑒定技術(shù)流程，品種間差異位點(diǎn)數(shù)≥2則可判定為不同品種。利用50個(gè)核心SNP位點(diǎn)構(gòu)建的指紋圖譜，各品種間差異位點(diǎn)數(shù)均≥2，因此，利用該DNA指紋圖譜可對(duì)甘藍(lán)品種進(jìn)行有效區(qū)分。

圖1 417個(gè)SNP標(biāo)記的多態(tài)性信息含量分布情況Fig. 1 Distribution of polymorphism information content in 417 SNP markers

圖2 基于417個(gè)SNP標(biāo)記的59個(gè)主要甘藍(lán)品種的雜合基因型比例Fig. 2 Heterozygous genotype ratio of 59 main varieties based on 417 SNPs

2.3 主要甘藍(lán)品種的聚類分析

根據(jù)50個(gè)核心位點(diǎn)的分型結(jié)果，利用NTSYS軟件對(duì)59個(gè)供試品種進(jìn)行聚類分析（圖3）。結(jié)果表明，育成品種兩兩間的遺傳相似系數(shù)為0.43—0.98。其中，‘秦甘 78號(hào)’與‘爭(zhēng)春’的遺傳相似系數(shù)最小，為0.43，二者之間存在41個(gè)差異標(biāo)記，這說明二者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。而‘中甘21’與‘中甘628’的遺傳相似系數(shù)最大，為0.98，二者之間的差異標(biāo)記僅有2個(gè)，說明它們的遺傳背景很相似。分析‘中甘21’與‘中甘 628’的系譜發(fā)現(xiàn)，二者的父本完全相同，母本都是圓球春甘藍(lán)材料。

在遺傳相似系數(shù)0.60處，可將所有供試品種分為兩大類群。第一大類群共包含33個(gè)品種，在遺傳相似系數(shù)0.64處可劃分為3個(gè)亞類，‘中甘8號(hào)’、‘晚豐’等11個(gè)品種為第1亞類；‘春豐’、‘博春’為第2亞類；第3亞類包含‘春甘2號(hào)’、‘爭(zhēng)春’等在內(nèi)的20個(gè)品種。第二大類主要為圓球或近圓球類型甘藍(lán)，共25個(gè)品種，在遺傳相似系數(shù)0.61處可劃分為2個(gè)亞類，將其命名為第4亞類與第5亞類。其中，第4亞類包含21個(gè)品種；第5亞類包含5個(gè)品種。聚類分析的結(jié)果與供試品種的來源有很強(qiáng)的相關(guān)性，例如：山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育成的惠豐系列甘藍(lán)、河南省

農(nóng)業(yè)科學(xué)院育成的豫甘系列甘藍(lán)、江蘇鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育成的瑞甘系列甘藍(lán)，上述單位培育的一系列甘藍(lán)品種之間呈現(xiàn)較近的親緣關(guān)系，聚類分析時(shí)聚在一起。結(jié)果表明，SNP聚類結(jié)果與供試品種的表型性狀和地理來源相一致，能準(zhǔn)確的反映供試品種的親緣關(guān)系。

表1 用于構(gòu)建指紋圖譜的50對(duì)核心引物Table 1 The information of 50 core primers for fingerprinting

續(xù)表1 Continued table 1

續(xù)表1 Continued table 1

續(xù)表1 Continued table 1

2.4 核心標(biāo)記在品種鑒定中應(yīng)用

通過人工構(gòu)建的虛擬混合群體對(duì)DNA指紋圖譜

的核心位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，利用50個(gè)核心SNP標(biāo)記對(duì)虛擬混合群體進(jìn)行基因分型檢測(cè)，并與已構(gòu)建的 DNA指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)?；蚍中徒Y(jié)果顯示：虛擬混合群體中來源于同一品種的3個(gè)樣品其分型結(jié)果完全相同，這說明核心SNP標(biāo)記具有較好的重復(fù)性。虛擬混合群體中有45個(gè)樣品（15個(gè)品種）的分型結(jié)果與DNA指紋圖譜中相應(yīng)品種完全對(duì)應(yīng)。剩余的15個(gè)樣品（5個(gè)新組合），與指紋庫中材料均表現(xiàn)出較大差異（差異位點(diǎn)數(shù)＞2），在指紋庫中無對(duì)應(yīng)品種。結(jié)果表明，利用50個(gè)核心SNP標(biāo)記可實(shí)現(xiàn)對(duì)甘藍(lán)品種真實(shí)性和特異性的有效鑒定。

表2 中國(guó)59 份主要甘藍(lán)品種的SNP-DNA 指紋圖譜數(shù)據(jù)庫Table 2 SNP-DNA Finger-printing database of 59 main cabbage varieties from China

續(xù)表2 Continued table 2

續(xù)表2 Continued table 2

續(xù)表2 Continued table 2

圖3 59個(gè)主要甘藍(lán)品種的SNP聚類分析圖Fig. 3 Cluster analysis dendrogram based on SNP for 59 main cabbage varieties

3 討論

3.1 主要甘藍(lán)品種的代表性

目前，中國(guó)甘藍(lán)種植面積約90萬hm2[20-21]，在蔬菜周年供應(yīng)中占據(jù)重要地位。中國(guó)甘藍(lán)品種選育開始于20世紀(jì)50年代、70年代以后得到快速發(fā)展。目前市場(chǎng)上審定推廣的甘藍(lán)品種大都為一代雜種，一代雜種的種植面積占總種植面積的90%以上[21]。

本試驗(yàn)中所選用的 59個(gè)甘藍(lán)品種全為一代雜種。在59個(gè)甘藍(lán)品種中，年推廣面積曾達(dá)到1×104hm2以上[23]且目前還有大面積種植的品種就有十幾個(gè)，如‘京豐一號(hào)’、‘8398’、‘中甘21’、‘晚豐’、‘慶豐’、‘中甘15’、‘中甘11’、‘春豐’、‘爭(zhēng)春’、‘西園四號(hào)’等，這些品種占到國(guó)內(nèi)甘藍(lán)種植面積的 60%—70%[24]。本試驗(yàn)中所選的59個(gè)主要甘藍(lán)品種涵蓋了不同球型（圓球、扁球、牛心型）、不同栽培季節(jié)（春甘藍(lán)、秋甘藍(lán)、越冬甘藍(lán)）及不同熟性（早、中、晚熟），這些品種具有廣泛的代表性。

3.2 基于SNP位點(diǎn)構(gòu)建DNA指紋圖譜

DNA指紋圖譜技術(shù)（DNA-Fingerprinting）是由英國(guó)科學(xué)家Jeffreys于1986年開發(fā)，具有快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，是鑒別品種、品系的有力工具，已廣泛應(yīng)用于很多作物的品種資源多樣性和純度鑒定研究，陸續(xù)將RFLP、AFLP、SSR、SNP等標(biāo)記技術(shù)用于構(gòu)建DNA指紋圖譜。其中，SSR指紋技術(shù)由于其重復(fù)性好、簡(jiǎn)單易于操作、且大多數(shù)為共顯性標(biāo)記，常用于品種鑒定分析，已在水稻[25]、玉米[26]、柑橘[27]、甜瓜[28]等多種作物中得到應(yīng)用。在甘藍(lán)中，基于SSR標(biāo)記已建立了50個(gè)代表品種的指紋圖譜，并制定了 SSR分子標(biāo)記法進(jìn)行甘藍(lán)品種鑒定的技術(shù)規(guī)程（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：NY/T 2473-2013）。但SSR標(biāo)記在實(shí)際使用中也暴露出一些不足，如標(biāo)記數(shù)量有限、檢測(cè)位點(diǎn)少，位點(diǎn)存在一定的突變率、對(duì)變異反應(yīng)比較敏感等。SNP指紋技術(shù)是繼RFLP和SSR之后發(fā)展起來的第3代標(biāo)記技術(shù)，具有數(shù)量多、分布廣泛、穩(wěn)定性高、易于快速且高通量地進(jìn)行基因型分型等優(yōu)點(diǎn)[8]。與 SSR相比，SNP是基于單核苷酸的突變，突變頻率更低，遺傳穩(wěn)定性更高。SNP標(biāo)記是構(gòu)建 DNA指紋數(shù)據(jù)庫的推薦標(biāo)記之一，但是目前甘藍(lán)中尚沒有基于SNP標(biāo)記的指紋圖譜。因此，構(gòu)建基于SNP標(biāo)記技術(shù)的指紋圖譜對(duì)于甘藍(lán)品種特異性和真實(shí)性鑒別、種子純度鑒定具有重要意義。

隨著SNP檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，SNP標(biāo)記的檢測(cè)成本也逐步降低。相對(duì)于SSR標(biāo)記，目前高通量大樣本的SNP標(biāo)記檢測(cè)已顯現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)。今后隨著品種數(shù)量的增多、品種指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的進(jìn)一步豐富，高通量的SNP檢測(cè)技術(shù)在新育成品種的真實(shí)性、特異性鑒定方面將具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

3.3 利用核心標(biāo)記構(gòu)建SNP-DNA指紋圖譜

指紋圖譜核心標(biāo)記的選擇視物種基因組的復(fù)雜程度、標(biāo)記類型、標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)、品種數(shù)量等情況而定?？锩偷萚29]利用36對(duì)SSR引物作為核心標(biāo)記，構(gòu)建了32個(gè)棉花主栽品種的指紋圖譜。王立新[30]在小麥品種鑒定中提出使用21對(duì)核心引物、84對(duì)備用引物進(jìn)行指紋研究。王慶彪等[5]使用 20對(duì)核心引物構(gòu)建了 50個(gè)甘藍(lán)品種的EST-SSR指紋圖譜，利用其中8對(duì)多態(tài)性較好的引物便可將50個(gè)品種全部區(qū)分開。因此對(duì)于不同物種，構(gòu)建指紋圖譜的核心標(biāo)記數(shù)量應(yīng)視物種基因組復(fù)雜程度而定。SSR標(biāo)記數(shù)量豐富、多態(tài)性高、呈共顯性，可鑒別雜合子和純合子，可用少量標(biāo)記鑒別大量物種。與SSR標(biāo)記不同，SNP標(biāo)記雖然穩(wěn)定性高但呈二態(tài)性，單個(gè)標(biāo)記的多態(tài)性信息含量較低，鑒別相同數(shù)量品種所需要的標(biāo)記數(shù)多于SSR標(biāo)記。本研究中，篩選出了50個(gè)核心SNP位點(diǎn)用于主要甘藍(lán)品種的指紋圖譜構(gòu)建，由于SNP標(biāo)記的二態(tài)性，理論上每個(gè)標(biāo)記可區(qū)分的雜交種數(shù) N1=3，本研究中選取得50個(gè)標(biāo)記可區(qū)分的最大雜交種數(shù)N=3^50=7.18×1023，出現(xiàn)相同指紋圖譜的概率P=1.39×10-24。因此，理論上而言，利用50個(gè)核心SNP標(biāo)記構(gòu)建甘藍(lán)主要品種的指紋圖譜是完全可行的。

SNP-DNA指紋圖譜的構(gòu)建方式也與SNP檢測(cè)方法有關(guān)。目前常用的SNP檢測(cè)及分型的方法主要有以下幾種，基于凝膠電泳檢測(cè)的等位基因特異性PCR[31]、單鏈構(gòu)象多態(tài)性[32]、酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列法[33]等；高通量自動(dòng)化檢測(cè)的直接測(cè)序法、DNA芯片技術(shù)[34]、競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR[17]等。等位基因特異性PCR、酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列法等SNP檢測(cè)方法由于其操作繁瑣、準(zhǔn)確率較低，不適用于構(gòu)建指紋圖譜。目前，利用 DNA 芯片技術(shù)是檢測(cè) SNP 的最常用方法，已在玉米[14]、油菜[15]等作物的指紋圖譜構(gòu)建中得到應(yīng)用。利用 DNA芯片技術(shù)可直接進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建，不需要進(jìn)行核心標(biāo)記篩選，但該方法制作DNA指紋圖譜的成本較高。相比于DNA芯片技術(shù)，利用KASP技術(shù)進(jìn)行SNP檢測(cè)的成本較低，其成本與檢測(cè)的SNP位點(diǎn)數(shù)呈正相關(guān)。從發(fā)展趨勢(shì)來看，近年來隨著甘藍(lán)基因組重測(cè)序的陸續(xù)開展，越來越多的SNP標(biāo)記得到開發(fā)，加上SNP標(biāo)記相比SSR標(biāo)記的一些優(yōu)勢(shì)，將來會(huì)更多地依賴于SNP標(biāo)記進(jìn)行品種的特異性、真實(shí)性鑒定。本研究中，利用KASP技術(shù)進(jìn)行SNP檢測(cè)并篩選出50個(gè)核心SNP位點(diǎn)用于構(gòu)建59個(gè)主要甘藍(lán)品種的指紋圖譜，隨著育種技術(shù)的發(fā)展、育成品種數(shù)量的增多，也有可能還需要增加 SNP標(biāo)記，尤其是與重要農(nóng)藝性狀緊密關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，以更準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)出品種的真實(shí)性、特異性。同時(shí)，希望可以為新品種保護(hù)授權(quán)提供前期的鑒定工作，利用指紋圖譜對(duì)品種進(jìn)行初步鑒定，最終結(jié)合田間表型鑒定判定品種的特異性、真實(shí)性。

4 結(jié)論

利用50份甘藍(lán)高代自交系重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，共開發(fā)2.54×106個(gè)SNP位點(diǎn)。將442個(gè)SNP位點(diǎn)成功轉(zhuǎn)化為KASP標(biāo)記，并從中開發(fā)出一套適用于中國(guó)甘藍(lán)品種指紋圖譜構(gòu)建的核心SNP組合，構(gòu)建了中國(guó)59個(gè)甘藍(lán)品種指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。通過人工構(gòu)建模擬群體驗(yàn)證，證明核心SNP組合可實(shí)現(xiàn)對(duì)甘藍(lán)品種真實(shí)性和特異性的有效鑒定。