金澄艷，呂曉陽(yáng)，高雯，王悅，陳煒昊，盛水興，陳玲，林杰，孫偉

（1揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009；2蘇州市畜牧獸醫(yī)站，江蘇蘇州215200；3丹陽(yáng)市皇塘鎮(zhèn)動(dòng)物防疫站，江蘇丹陽(yáng)213027）

0 引言

【研究意義】湖羊是中國(guó)獨(dú)有的白色羔皮羊品種，也是世界著名的多胎綿羊品種。其羔皮呈水波狀花紋，色澤潔白、毛質(zhì)柔軟、撲而不散，在國(guó)內(nèi)外裘皮市場(chǎng)享有盛譽(yù)。毛囊作為皮膚的衍生物，調(diào)節(jié)湖羊毛發(fā)的生長(zhǎng)，可分為生長(zhǎng)有髓毛的初級(jí)毛囊和生長(zhǎng)無(wú)髓毛的次級(jí)毛囊。毛囊的發(fā)育及其再生由多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和表觀遺傳調(diào)節(jié)因子控制[1-3]。miRNA是參與轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平調(diào)節(jié)的重要因子，是表型調(diào)控的重要潛在位點(diǎn)。目前對(duì) miRNA的功能已有一定的了解，但其在毛囊發(fā)育中的作用機(jī)制還不完全清楚。研究與毛囊生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的候選 miRNA可進(jìn)一步了解湖羊毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育，從分子遺傳規(guī)律上揭示湖羊羔皮形成不同花紋的分子機(jī)理及其調(diào)控機(jī)制，從而制定提高湖羊羔皮質(zhì)量的育種方案?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，在綿羊、山羊和鴨等動(dòng)物上，已有使用皮膚和毛發(fā)或毛囊中的 miRNA表達(dá)譜來(lái)鑒定與毛囊發(fā)育和生長(zhǎng)相關(guān)的miRNA[4-8]。研究發(fā)現(xiàn)，一些miRNA能夠影響皮膚毛囊細(xì)胞的增殖分化及毛色[9]，其相關(guān)靶基因在調(diào)控毛囊周期性生長(zhǎng)的過(guò)程中充當(dāng)重要的角色[10-12]。目前，miRNA-143已被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用，在這些惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)miR-143，細(xì)胞生長(zhǎng)會(huì)受到限制，這也就提示miR-143參與細(xì)胞的分化、增殖、凋亡及新陳代謝過(guò)程[13-20]。let-7c和let-7i都屬于極為重要的抑癌 miRNA的let-7家族，在多種惡性腫瘤中低表達(dá)，其可以調(diào)控部分與細(xì)胞周期相關(guān)的基因，參與細(xì)胞凋亡過(guò)程[21-23]。miR-199a-3p參與細(xì)胞的增殖、發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程，miR-199a-3p可以抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，減少腫瘤細(xì)胞增殖、遷移與侵染[24-28]。此外，miR-199a-3p還參與C2C12成肌細(xì)胞的細(xì)胞分化[29]。miRNA-10a也參與細(xì)胞的增殖、遷移等過(guò)程，但與miR-199a-3p抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵染相反，miRNA-10a能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[30-31]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本課題組前期利用安捷倫基因芯片技術(shù)及GO功能分析，篩得初生湖羊大花和小花皮膚組織差異表達(dá)基因，如 BMP7、MMP2、SNAI1、SFXN1、CDKNIC、MT3、POU1F1等對(duì)湖羊大花、小花性狀形成可能具有重要影響的候選基因[32]?；谇捌诶酶咄繙y(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)分析篩選湖羊大花、中花、小花羔皮毛囊差異表達(dá)miRNA，結(jié)果表明miRNA-143、miRNA-10a、let-7c、miRNA-199a-3p、let-7i 、NW_004080189.1_7961、NW_004080184.1_6535、NW_004080184.1_6326、NW_004080165.1_8572、NW_004080166.1_9139、NW_004080181.1_3961、NW_004080174.1_726、NW_004080166.1_10417、NW_004080190.1_13733等候選miRNA可能參與湖羊不同花紋的形成，但尚無(wú)這些差異表達(dá) miRNA在湖羊羔皮毛囊中表達(dá)值與毛囊發(fā)育之間的詳細(xì)資料。目前關(guān)于綿羊毛囊的研究主要集中于生長(zhǎng)周期的研究[2]，關(guān)于miRNA表達(dá)與毛囊發(fā)育的研究在湖羊這一優(yōu)質(zhì)羔皮用羊品種上尚屬空白?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究擬通過(guò)分析剛出生湖羊大花、中花、小花毛囊發(fā)育狀況和miRNA-143、miRNA-10a、let-7c、miRNA-199a-3p、let-7i、W_004080189.1_7961、NW_004080184.1_6535等14個(gè)候選miRNA表達(dá)變化及兩者相關(guān)性，揭示這14個(gè)miRNA在毛囊發(fā)育中的作用，篩選候選miRNA，為湖羊優(yōu)質(zhì)羔皮的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

研究于2014年8—12月在揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物遺傳育種與分子設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試驗(yàn)群體

選取6組出生2d內(nèi)的湖羊全同胞個(gè)體（由蘇州市種羊場(chǎng)提供），每組全同胞個(gè)體分別包含大、中、小花各一只。在湖羊羔羊活體狀態(tài)下，從其背側(cè)部成股拔取羊毛，在距離羊毛根部毛囊泡1cm處用剪刀將羊毛剪斷，放入裝有Trizol的1.5mL離心管中。一般情況下，每個(gè)1.5mL離心管中加入1mL Trizol，毛囊收集至Trizol體積的1/3，并用小型塑料研磨杵在離心管內(nèi)迅速研磨，一般研磨時(shí)間為 1min左右，完成后蓋好，用封口膜封好離心管。輕甩離心管使毛囊完全浸入到Trizol液體中，在避光條件下，24h內(nèi)將裝有樣品的離心管放入-20℃凍存?zhèn)溆?。將羔羊另一?cè)背側(cè)部剪毛，剪取約1.5 cm2的皮膚組織，并將其展平貼于硬紙板上，連同硬紙板一起放入裝有 4%甲醛溶液的離心管中固定備用。

1.2 主要試劑及儀器

miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒、ABI 7500熒光定量PCR儀、石蠟切片機(jī)、甲醛、蘇木素、伊紅、中性樹(shù)脂等。

1.3 石蠟切片的制作

將羔皮皮膚組織按常規(guī)石蠟切片制片流程，經(jīng)脫水、透明、包埋、切片、H.E染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察毛囊結(jié)構(gòu)，并利用顯微成像系統(tǒng)拍照，每張切片選擇3個(gè)不同視野，統(tǒng)計(jì)初級(jí)毛囊數(shù)、次級(jí)毛囊數(shù)、初級(jí)毛囊直徑、次級(jí)毛囊直徑，并用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），統(tǒng)計(jì)分析毛囊各指標(biāo)在大、中和小花之間的差異顯著性。

1.4 Real-time PCR

采用Trizol 法提取樣品RNA。利用天根miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒生成miRNA對(duì)應(yīng)的cDNA。引物由上海生工合成，引物信息見(jiàn)表1。以U6作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，反應(yīng)體系參考天根miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒（天根，目錄號(hào)：FP401）說(shuō)明書(shū)。

表1 熒光定量引物序列Table 1 Relevant information of genes and primers sequence for RT-PCR

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，其中 ΔCt＝Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt＝ΔCt（大花組、中花組）－ΔCt（小花組），利用 SPSS17.0 計(jì)算重復(fù)樣品間的 Ct均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 湖羊大、中、小花不同花紋羔皮毛囊的組織學(xué)觀察

湖羊大花、中花和小花羔皮皮膚組織切片顯微照片如圖1所示，毛囊各指標(biāo)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2。

從圖1湖羊大、中和小花毛囊切片照片中可以看出，在大花、中花和小花羔皮毛囊中，直徑較大的為初級(jí)毛囊，直徑相對(duì)較小的為次級(jí)毛囊，毛囊分布以毛囊群形式為主，即以初級(jí)毛囊為中心，次級(jí)毛囊圍繞在初級(jí)毛囊的一側(cè)。

表2毛囊各指標(biāo)數(shù)據(jù)顯示，在顯微鏡相同視野中，湖羊大花、中花、小花3種不同類型花紋羔皮的初級(jí)毛囊數(shù)差異不顯著（P＞0.05）；小花組的次級(jí)毛囊數(shù)多于大花組和中花組的次級(jí)毛囊數(shù)且差異極顯著（P＜0.01），中花組與小花組二者次級(jí)毛囊數(shù)相仿，差異不顯著（P＞0.05）。因此，在相同的單位面積中，小花的毛囊總數(shù)要高于大花組和中花組。大花組的初級(jí)毛囊直徑比中花組和小花組的初級(jí)毛囊直徑要大的多，與中花組和小花組的初級(jí)毛囊直徑均差異極顯著（P＜0.01），大花組的次級(jí)毛囊直徑也比中花組和小花組的次級(jí)毛囊直徑大，同時(shí)二者差異極顯著（P＜0.01），中花組和小花組二者的初級(jí)毛囊直徑以及次級(jí)毛囊直徑均差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 湖羊大花、中花、小花毛囊橫切圖Fig. 1 Transverse section images of large, medium and small waves（100×）

表2 湖羊大、中、小花毛囊各指標(biāo)測(cè)定Table 2 Determination indexes of large, medium and small waves

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

為驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性，本研究從測(cè)序篩選出的顯著差異miRNA中隨機(jī)選取了5個(gè)，利用與測(cè)序送樣相同的樣品進(jìn)行了熒光定量 PCR驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果與差異表達(dá)的miRNA的RT-PCR基本相同（表3）。

2.3 14個(gè)差異miRNA在大花、中花和小花羔皮毛囊中的表達(dá)

由表4可知，在已知的miRNA中，miRNA-143在大花組中的表達(dá)量與小花組差異極顯著（P＜0.01），miRNA-10a在小花組的表達(dá)量與大花和中花組相比差異顯著（P＜0.05），let-7i在大花組的表達(dá)量與中花組差異顯著（P＜0.05）；在測(cè)序新預(yù)測(cè)的差異miRNA中， NW_004080184.1_6326在中花組的表達(dá)量與大花組差異顯著（P＜0.05），與小花組差異極顯著（P＜0.01），NW_004080165.1_8572在中花組的表達(dá)量與大花組和小花組差異極顯著（P＜0.01），NW_004080181.1_3961在中花組的表達(dá)量與小花組差異極顯著（P＜0.01），NW_004080190.1_13733在中花組的表達(dá)量與大花組差異極顯著（P＜0.01）。其余miRNA在大、中和小花中的表達(dá)差異不顯著。

2.4 14個(gè)差異miRNA熒光定量表達(dá)值與毛囊各指標(biāo)的相關(guān)分析

根據(jù)6組湖羊（大花組、中花組和小花組）背側(cè)部皮膚組織切片各指標(biāo)統(tǒng)計(jì)結(jié)果及14個(gè)miRNA在3組花型中的表達(dá)情況，利用SPSS17.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，分別計(jì)算14個(gè)miRNA與3組不同花紋毛囊指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)，分析14個(gè)miRNA表達(dá)情況與毛囊各指標(biāo)的相關(guān)性。分析結(jié)果如表5所示：14個(gè) miRNA的相對(duì)表達(dá)量均與毛囊部分指標(biāo)存在相關(guān)性，表明14個(gè)miRNA均有可能參與毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育。通過(guò)使用SPSS 17.0分析了14種miRNA的表達(dá)與毛囊各組織學(xué)性質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)，表明它們參與毛囊的生長(zhǎng)和發(fā)育。

表3 差異miRNA的測(cè)序與熒光定量Table 3 The companions on the results of sequencing and RT PCR for differentially expressed miRNA

表4 大花、中花、小花毛囊14個(gè)miRNA相對(duì)表達(dá)量Table 4 Relative expression quantities of 14 miRNAs in large, medium and small waves hair follicle

表5 14個(gè)miRNA相對(duì)表達(dá)量與毛囊組織學(xué)特性關(guān)聯(lián)分析Table 5 Correlation between the expressed miRNA and the indicators follicles

續(xù)表5 Continued table 5

3 討論

3.1 14個(gè)miRNA在湖羊大、中和小不同花紋個(gè)體間的表達(dá)

在這些miRNA中，miRNA-143作為測(cè)序所篩得的湖羊毛囊組織表達(dá)豐度較高的 miRNA之一，在本研究的結(jié)果中顯示，miRNA-143同一時(shí)期在小花中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于大花和中花，且在大花和小花羔皮毛囊中的表達(dá)量差異極顯著。由此可推測(cè)，miRNA-143很可能參與毛囊細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程，參與被毛生長(zhǎng)的調(diào)控。但是，關(guān)于miRNA-143在動(dòng)物毛囊領(lǐng)域的研究尚未有相關(guān)報(bào)道，以前的研究表明，miRNA-143在各種惡性腫瘤中起重要作用[33-34]。據(jù)報(bào)道，miRNA-143在膀胱癌[16]、前列腺癌[18]、乳腺癌[19]和胃癌[20]中表達(dá)下調(diào)，在這些惡性腫瘤中，miR-143的表達(dá)上調(diào)抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)。

miRNA-10a以及l(fā)et-7i兩個(gè)miRNA的研究目前也主要集中于腫瘤方面，在動(dòng)物毛囊領(lǐng)域也尚無(wú)報(bào)道。miRNA-10a在腫瘤中的作用主要體現(xiàn)在它能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程[30-31]，這一點(diǎn)與let-7i正好相反，let-7i作為重要的抑癌miRNA家族let7家族的一員，它在腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)，參與細(xì)胞凋亡過(guò)程[22-23]。本研究結(jié)果顯示，miRNA-10a和let-7i分別在湖羊中花與小花、大花與中花中的表達(dá)量差異顯著，由此推測(cè)，miRNA-10a和let-7i在不同花紋羔皮毛囊中的差異表達(dá)可能會(huì)對(duì)湖羊毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響。

在新miRNA中，NW_004080184.1_6326在小花與大花中的表達(dá)量高于中花，且小花組的表達(dá)量與中花組差異極顯著，NW_004080165.1_8572在大花與小花中的表達(dá)量高于中花組且均與中花組差異極顯著，NW_004080181.1_3961和NW_004080190.1_13733分別在中花和小花組、大花和中花組差異極顯著。這些通過(guò)測(cè)序得到的新的 miRNA在湖羊不同花紋羔皮毛囊中的差異表達(dá)，也很可能在羔皮花紋的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，這也需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，其余的7個(gè)miRNA在大、中、小花3組的表達(dá)差異均不顯著，暫時(shí)不列入候選miRNA的選擇范圍。因此，可初步推測(cè)miRNA-143、miRNA-10a、let-7i、NW_004080184.1_6326、NW_004080165.1_8572、NW_004080181.1_3961、NW_004080190.1_13733 等7個(gè) miRNA可以作為參與湖羊毛囊發(fā)育調(diào)控的候選miRNA。

3.2 14個(gè)miRNA在湖羊不同花紋羔皮毛囊中的表達(dá)與毛囊各指標(biāo)之間的相關(guān)分析

目前，通過(guò)對(duì)人類以及模式動(dòng)物如小鼠等miRNA的研究已證實(shí)，miRNA在腦、心臟、肝臟、皮膚等各種組織及器官的發(fā)育過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用[35-39]，而且 miRNA的表達(dá)還呈現(xiàn)出不同發(fā)育階段特異性表達(dá)和組織特異性表達(dá)的特點(diǎn)。當(dāng)前對(duì)于皮膚及毛囊的研究表明，miRNA參與多種動(dòng)物表皮的發(fā)生及毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。ANDL等進(jìn)一步研究表明，miRNA在毛囊周期性生長(zhǎng)的不同時(shí)期的表達(dá)存在差異性，miRNA是調(diào)控皮膚和毛囊生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的重要因子[40]。關(guān)于 miRNA-143在動(dòng)物毛囊領(lǐng)域的研究目前還尚未有相關(guān)報(bào)道，miRNA-143主要在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用，參與細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程的調(diào)控。本研究結(jié)果表明，在miRNA-143表達(dá)量相同的情況下，小花次級(jí)毛囊數(shù)大于大花次級(jí)毛囊數(shù)，這與切片結(jié)果相符，結(jié)合miRNA-143在大花、中花和小花間表達(dá)差異研究初步推測(cè)，miRNA-143可能對(duì)湖羊毛囊發(fā)育起調(diào)控作用。

目前關(guān)于miRNA-10a和let-7i也尚無(wú)毛囊生長(zhǎng)發(fā)育方面的研究，本研究結(jié)果顯示，在miRNA-10a表達(dá)量相同的情況下，大花初級(jí)毛囊直徑大于小花次級(jí)毛囊直徑，大花次級(jí)毛囊數(shù)小于中花和小花的次級(jí)毛囊數(shù)，這些結(jié)果與切片數(shù)據(jù)相吻合。此外，在let-7i表達(dá)量相同的情況下，結(jié)果顯示大花次級(jí)毛囊數(shù)小于中花次級(jí)毛囊數(shù)，而在切片結(jié)果中，大花的次級(jí)毛囊數(shù)和中花的次級(jí)毛囊數(shù)接近，差異并不顯著，因此在這一點(diǎn)與切片數(shù)據(jù)稍有出入；出現(xiàn)此情況可能是由于樣本量不足導(dǎo)致的，因?yàn)楸驹囼?yàn)的研究對(duì)象為湖羊大、中和小花不同花紋的全同胞個(gè)體，此類全同胞個(gè)體較為稀少。但在let-7i表達(dá)量相同的情況下，大花初級(jí)毛囊直徑大于中花初級(jí)毛囊直徑，這一結(jié)果還是符合切片結(jié)果的。因此，這些相關(guān)性分析結(jié)果與相應(yīng)的切片數(shù)據(jù)基本吻合。此外，在所篩得的新miRNA中，NW_004080184.1_6326、NW_004080165.1_8572、NW_004080181.1_3961以及 NW_004080190.1_13733等在大、中和小花組的表達(dá)量也分別與大花次級(jí)毛囊直徑、小花次級(jí)毛囊數(shù)和中花次級(jí)毛囊直徑等指標(biāo)存在相關(guān)性，且分析結(jié)果也與切片數(shù)據(jù)相符合。其余的miRNA雖然與毛囊的相關(guān)指標(biāo)也存在關(guān)聯(lián)性，但鑒于其在大、中和小花組的表達(dá)差異不顯著，可將其排除在候選miRNA的選擇范圍之外。

4 結(jié)論

綜合14個(gè)miRNA在大花、中花和小花毛囊中的表達(dá)情況以及表達(dá)值與毛囊各指標(biāo)的相關(guān)性分析，miRNA-143、miRNA-10a、let-7i、NW_004080184.1_6326、NW_004080165.1_8572、NW_004080181.1_3961和NW_004080190.1_13733可以作為湖羊羔皮毛囊發(fā)育的重要候選miRNA，在后續(xù)試驗(yàn)中將進(jìn)行更深入的研究。