宋晶晶 王 海

浙江省立同德醫(yī)院 浙江 杭州 310012

宮頸癌在女性群體中是發(fā)病率很高的婦科腫瘤，手術(shù)和化療目前仍是治療宮頸癌的主要手段[1-2]。本研究主要探討天然藥物川楝素是否對(duì)順鉑誘導(dǎo)的凋亡有協(xié)同作用并研究其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料：順鉑、噻唑藍(lán)（MTT）、二甲亞砜（DMSO）和Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：APOAF)購(gòu)于德國(guó)Sigma-Al dr ich公司。川楝素購(gòu)于南京春秋生物工程有限公司。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。細(xì)胞蛋白提取液、JC-1線粒體膜電位染料和線粒體分離試劑盒(批號(hào)：C3601)購(gòu)于江蘇碧云天。c-Jun、Bcl-xl、caspase-9、caspase-3和β-act in抗體購(gòu)于美國(guó)Cel l Signal ing公司。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物（ECL）試劑盒(貨號(hào)：32106)購(gòu)于美國(guó)Pier ce公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)：人宮頸癌細(xì)胞系Hel a購(gòu)于美國(guó)ATCC（Amer ican Type Cul tur e Col l ect ion），Hel a細(xì)胞系培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通入5%CO2。

1.3 c-Jun表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染：人c-Jun基因的開放閱讀框架全長(zhǎng)序列經(jīng)PCR擴(kuò)增后以分子克隆的方法與pc DNA3.1連接后構(gòu)建成c-Jun重組過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。c-Jun過(guò)表達(dá)質(zhì)粒用脂質(zhì)體2000按試劑操作說(shuō)明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染：將2g/ml質(zhì)粒用脂質(zhì)體2000進(jìn)行包裹后將其加入到無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行混合。將貼壁的Hel a細(xì)胞置于該無(wú)血清培養(yǎng)基孵育6小時(shí)后棄去無(wú)血清培養(yǎng)基并加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)。

1.4 細(xì)胞活力檢測(cè)：將Hel a細(xì)胞按5×103/孔接種在96孔板上，分為對(duì)照組，川楝素組，順鉑組，順鉑+川楝素組及順鉑+川楝素+c-Jun質(zhì)粒組（簡(jiǎn)稱綜合組）。對(duì)照組為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hel a細(xì)胞不加藥物培養(yǎng)48小時(shí)，順鉑組為在空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hel a細(xì)胞中加入2mol/L的順鉑培養(yǎng)48小時(shí)，川楝素組為在空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hel a細(xì)胞中加入10mol/L的川楝素培養(yǎng)48小時(shí)，順鉑+川楝素組為在空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hel a細(xì)胞中加入2mol/L的順鉑和10mol/L的川楝素培養(yǎng)48小時(shí)，綜合組為在c-Jun質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hel a細(xì)胞中加入2mol/L的順鉑和10mol/L的川楝素培養(yǎng)48小時(shí)。藥物處理完畢后在各培養(yǎng)孔中加入20μl 5mg/ml MTT再培養(yǎng)4小時(shí)，小心吸去上清液，往孔中加入150μl DMSO，充分震蕩后在570nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，Hel a細(xì)胞活力抑制率計(jì)算：抑制率=（OD對(duì)照組-OD藥物處理組）/OD對(duì)照組×100%。

1.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：將Hel a細(xì)胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述進(jìn)行分組處理。處理完畢后按照Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書用Annexin-V對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色孵育20分鐘。之后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Hel a細(xì)胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比表示。

1.6 線粒體膜電位測(cè)定：將Hel a細(xì)胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述進(jìn)行分組處理。藥物處理完畢后按試劑操作說(shuō)明書步驟將細(xì)胞用JC-1染料進(jìn)行孵育，孵育完畢后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)JC-1發(fā)出的紅色熒光，紅色熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，線粒體膜電位越高。

1.7 West er n bl ot實(shí)驗(yàn)：將Hel a細(xì)胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述進(jìn)行分組處理。藥物處理完畢后將細(xì)胞用蛋白提取液提取總蛋白質(zhì)。之后將提取的總蛋白質(zhì)用12.5%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離。分離完畢后通過(guò)電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到醋酸纖維素膜上，用c-Jun、Bcl-xl、caspase-9、caspase-3和βact in抗體孵育過(guò)夜，之后再用帶辣根過(guò)氧化物酶的二抗孵育2小時(shí)，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用-x±s表示，并用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 川楝素和順鉑處理下的Hel a細(xì)胞的細(xì)胞活力抑制率和凋亡率：見表1。

2.2 川楝素通過(guò)c-Jun/Bcl-xl途徑提高Hel a細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)的凋亡信號(hào)的敏感性：West ern bl ot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示順鉑單獨(dú)處理會(huì)增加Hel a細(xì)胞中Bcl-xl的表達(dá)水平，而川楝素聯(lián)合處理能明顯抑制Hel a細(xì)胞中Bclxl的異常表達(dá)。然而轉(zhuǎn)染c-Jun表達(dá)質(zhì)粒后，川楝素對(duì)Bcl-xl的抑制作用明顯減弱（圖1），表明川楝素通過(guò)c-Jun途徑發(fā)揮Bcl-xl表達(dá)的抑制作用。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示川楝素聯(lián)合順鉑能顯著誘導(dǎo)Hel a細(xì)胞線粒體膜電位的下降，然而轉(zhuǎn)染c-Jun質(zhì)粒后，線粒體膜電位的降低受到抑制（圖2）。同時(shí)，川楝素能明顯促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的凋亡執(zhí)行分子caspase-9和caspase-3的活化（圖3）。這些結(jié)果表明川楝素通過(guò)c-Jun/Bcl-xl途徑提高Hel a細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)的凋亡信號(hào)的敏感性。

表1 川楝素和順鉑處理下的Hel a細(xì)胞的細(xì)胞活力抑制率和凋亡率（，%）

表1 川楝素和順鉑處理下的Hel a細(xì)胞的細(xì)胞活力抑制率和凋亡率（，%）

注：與順鉑組比較，*P＜0.05；與川楝素組比較，#P＜0.05；與順鉑+川楝素組比較，&P＜0.05。

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圖1 川楝素和順鉑對(duì)Hel a細(xì)胞Bcl-xl表達(dá)水平的影響

圖2 順鉑和川楝素對(duì)Hel a細(xì)胞線粒體膜電位的影響

圖3 順鉑和川楝素對(duì)Hel a細(xì)胞caspase-9及caspase-3活化的影響

3 討論

川楝素是中藥川楝子中的主要活性成分，具有很強(qiáng)的藥理學(xué)活性。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)川楝素還具有一定的抗腫瘤作用，對(duì)多種惡性腫瘤均有良好的輔助治療作用[3]，具有高效低毒的特點(diǎn)。然而，川楝素是否對(duì)宮頸癌的順鉑化療有輔助治療作用，至今還未充分報(bào)道。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)川楝素聯(lián)合處理能顯著提高宮頸癌細(xì)胞在順鉑治療下的細(xì)胞活力抑制率和凋亡率，表明川楝素是一種良好的化療輔助治療藥物，能顯著提高宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)的凋亡作用的敏感性。

c-Jun是一種轉(zhuǎn)錄因子蛋白，屬于核轉(zhuǎn)錄激活蛋白1家族成員。研究表明當(dāng)腫瘤細(xì)胞的DNA受順鉑等化療藥物損傷時(shí)，c-Jun蛋白會(huì)發(fā)生活化，活化的c-Jun能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[4]。更為重要的，文獻(xiàn)報(bào)道c-Jun的過(guò)度活化是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生化療抵抗的重要機(jī)制[5]。在本研究中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)宮頸癌細(xì)胞用順鉑進(jìn)行治療時(shí)，宮頸癌細(xì)胞中的c-Jun蛋白會(huì)發(fā)生過(guò)表達(dá)以對(duì)抗順鉑對(duì)宮頸癌細(xì)胞的殺傷。然而當(dāng)用川楝素進(jìn)行聯(lián)合治療時(shí)，宮頸癌細(xì)胞中的c-Jun蛋白表達(dá)水平受到明顯抑制，并由此抑制了順鉑引起的c-Jun蛋白的過(guò)表達(dá)，這可能是川楝素增強(qiáng)順鉑抗宮頸癌活性的機(jī)制。當(dāng)在宮頸癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染c-Jun重組表達(dá)質(zhì)粒使c-Jun在宮頸癌細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)后，川楝素對(duì)順鉑的協(xié)同抗宮頸癌活性受到了明顯的抑制，證明了c-Jun的下調(diào)是川楝素發(fā)揮協(xié)同作用的重要機(jī)制。

作為c-Jun信號(hào)通路的下游蛋白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)宮頸癌細(xì)胞中的Bcl-xl抗凋亡蛋白在順鉑治療下會(huì)發(fā)生過(guò)表達(dá)以對(duì)抗順鉑誘導(dǎo)的凋亡，然而川楝素聯(lián)合處理能通過(guò)下調(diào)c-Jun蛋白的表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞中Bcl-xl的表達(dá)水平。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)川楝素能明顯促進(jìn)順鉑對(duì)宮頸癌細(xì)胞線粒體途徑凋亡的誘導(dǎo)，活化細(xì)胞中的caspase-9和caspase-3，最終導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。