王安妮，宋英輝，唐美玲，肖慧琳，鄭秋玲，王婷，張超杰*，王詠梅

（1. 山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東煙臺(tái) 265500；2. 蓬萊市葡萄與葡萄酒技術(shù)研究推廣中心， 山東蓬萊 265600；3. 山東省葡萄研究院，山東濟(jì)南 250100）

花色苷是花色素與糖以糖苷鍵結(jié)合而成的，呈現(xiàn)紅色、紫色或者藍(lán)色的一類酚類化合物[1]，對(duì)葡萄果實(shí)和葡萄酒顏色至關(guān)重要。葡萄果實(shí)中花色苷的組分和含量受氣候、土壤和栽培方式等因素影響[2-5]，但主要還是由遺傳物質(zhì)決定，與基因結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[6-7]。

花色苷是含有C6-C3-C6骨架的類黃酮類物質(zhì)[8]，由于B環(huán)上的取代基的位置和數(shù)量不同演變出了不同類型的花色苷，主要分為6類：花青素類（Cyanindin，Cy）、花葵素類（Pelargonidin，Pg）、花翠素類（Delphinidin，Dp）、甲基花青素類（Peonidin，Pn）、甲基花翠素類（Petunidin，Pt）和二甲花翠素類（Malvidin，Mv）。葡萄果皮中二甲花翠素類含量最高，而花葵素類含量極少，較不常見[9]。同時(shí)根據(jù)結(jié)構(gòu)又可分基本花色苷（非?；ㄉ眨┖王；ㄉ誟10]。?；ㄉ蛰^穩(wěn)定，在釀酒葡萄果實(shí)及葡萄酒中起到積極作用。

煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)原來(lái)主栽的紅色品種為‘赤霞珠’，但由于‘赤霞珠’抗性較差，近年來(lái)引進(jìn)了‘馬瑟蘭’和‘小味兒多’新型品種，其栽培面積逐年擴(kuò)大，逐漸成為主栽品種?！R瑟蘭’是‘赤霞珠’和‘歌海娜’的雜交品種，繼承了‘赤霞珠’的細(xì)致感和‘歌海娜’的耐熱性[11]；‘小味兒多’果皮厚且色澤深沉，有研究表明蓬萊地區(qū)‘小味兒多’花色苷總量高于‘赤霞珠’[12]?；ㄉ帐桥袛嗥咸丫破焚|(zhì)好壞的重要指標(biāo)[13-14]，不同釀酒葡萄品種之間花色苷的存在形式和所占比例有一定的差異。為進(jìn)一步豐富煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄栽培品種，本文采用HPLC法對(duì)3個(gè)品種花色苷的組成和含量進(jìn)行測(cè)定，分析花色苷的品種特性，為提高葡萄酒品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3個(gè)釀酒品種均采自于蓬萊龍湖酒莊。葡萄園土壤為棕壤土，肥力中等，排水良好。屬于暖溫帶海洋季風(fēng)氣候，年平均氣溫12.8 ℃，年日照時(shí)數(shù)2511.4 h，年平均降雨量為683.9 mm。3個(gè)品種樹齡均為4年，南北行向，株行距1 m×2 m，單干單臂＋直立葉幕整形。果實(shí)成熟時(shí)每個(gè)處理隨機(jī)取樣100粒漿果，放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室剝?nèi)」し湃胍旱兴賰?，然后用研缽磨成粉末放入真空冷凍干燥機(jī)-40 ℃下冷凍干燥24 h，果皮粉保存在-40 ℃冰箱內(nèi)備用。

花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷及二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品：Miragen公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、甲酸（分析純）：海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 Inf i nity高效液相色譜儀：德國(guó)waldbronn公司；電子天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；有機(jī)相過濾器：安捷倫科技有限公司；超純水器：四川優(yōu)普超純科技有限公司；IKA MS3 basic渦旋振蕩器：艾卡儀器設(shè)備有限公司；Centrifuge 5430R高速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

Intertsil ODS-3 Column色譜柱：250 mm×4.6 mm×5μm；流速：1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：525 nm；流動(dòng)相A，甲酸∶水＝1∶9，流動(dòng)相B，甲酸∶乙腈＝1∶9（梯度洗脫見表1）。

1.3.2 果皮花色苷的提取

準(zhǔn)確稱重果皮粉0.2 g放入研缽，加入1.5 mL的提取液（甲酸∶水∶甲醇＝2∶28∶70）繼續(xù)研磨至無(wú)明顯顆粒狀，并用移液槍吸取1 mL于離心管中。室溫下1500 r/min避光搖床震蕩10 min，然后4 ℃下13 000 r/min低溫離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾并收集到離心管內(nèi)。-80 ℃保存待測(cè)上機(jī)。

1.3.3 花色苷定性定量分析

采用花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-葡萄糖苷五種標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)葡萄果皮中的基本花色苷進(jìn)行定量。其它各類?；幕ㄉ諈⒖剂赫癫郎y(cè)定結(jié)果推斷色譜峰代表成分[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

表1 梯度洗脫條件和程序Table 1 Gradient elution conditions and procedures

采用IBM SPSS statistics 22軟件的單因素分析對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，顯著性水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精確稱取5種標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，用10%的甲酸溶液配制成質(zhì)量濃度為10、20、50、100、200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，在確定的色譜條件下上機(jī)測(cè)定，擬合5種花色苷的質(zhì)量濃度（y）和峰面積（x），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行定量分析。二甲花翠素3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性方程：y＝0.0154x－2.4549，R2＝0.9992；花翠素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性方程：y＝0.0274x＋1.5545，R2＝0.9994；甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性方程：y＝0.015x＋2.401，R2＝0.9996；花青素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性方程：y＝0.0174x＋0.3053，R2＝0.9995；甲基花青素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性方程：y＝0.0164x＋3.0154，R2＝0.9993。R2均在0.9992以上，線性關(guān)系良好，符合高效液相色譜的標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 花色苷組分分析

如表2、表3所示，3種紅色釀酒品種共檢測(cè)到15種花色苷，包括5大類花色苷，其中花青素類2種，花翠素類3種，甲基花青素類3種，甲基花翠素類3種，二甲基類花翠素4種?！∥秲憾唷汀嘞贾椤鶛z測(cè)出14種，而‘馬瑟蘭’只檢測(cè)出12種。其中花翠素-3-O葡萄糖苷-乙酸酯是‘赤霞珠’特有的組分；‘馬瑟蘭’缺少花青素-3-O葡萄糖苷和甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷-乙酸酯這兩種組分。

3個(gè)品種都檢測(cè)出2種雙葡萄糖苷，分別是甲基花青素-3-O-葡糖苷-5-O-葡萄糖苷-咖啡酸酯和二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷-5-葡萄糖苷-咖啡酸酯，其它的都是單葡萄糖苷。大多研究結(jié)果表明，雙葡萄糖苷花色苷僅存在于歐美種中，是其重要的顯色特征物質(zhì)，而歐亞種葡萄中只含有單葡萄糖苷花色苷。但近年來(lái)也有少數(shù)研究表明，一些歐亞種中也存在少量雙糖苷[16]。

3個(gè)品種都檢測(cè)到3種酰化的花色苷，分別是香豆酰化、乙?；涂Х弱；??！R瑟蘭’酰化花色苷相對(duì)含量較高為56.39%，且多以香豆?；男问酱嬖?。而‘小味兒多’和‘赤霞珠’未酰化花色苷比例高，約占50%以上，且?；ㄉ斩嘁砸阴；ㄉ招问酱嬖?。3個(gè)釀酒葡萄品種的咖啡?；ㄉ盏南鄬?duì)含量最低，均不到5%。

由表4所示，14種花色苷組分相對(duì)含量最高的均是二甲花翠素類，這與多個(gè)研究結(jié)果一致[17-19]。其中‘馬瑟蘭’的二甲基花翠素類的相對(duì)含量高達(dá)90%以上；‘小味兒多’‘赤霞珠’相對(duì)含量為80%左右；其次是甲基花青素類花色苷3個(gè)品種均在10%以下?！R瑟蘭’的花翠素類相對(duì)含量較低于甲基花翠素類，而‘赤霞珠’和‘小味兒多’與之相反。含量最低的是花青素類，‘赤霞珠’和‘馬瑟蘭’中相對(duì)質(zhì)量還不足1%。

3個(gè)釀酒葡萄品種相對(duì)含量最高的均為二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷。其中‘小味兒多’的相對(duì)含量最高為42.21%，其次是‘赤霞珠’為40.99%，而‘馬瑟蘭’占37.94%。三個(gè)釀酒葡萄品種中，‘馬瑟蘭’的花色苷組成較其他兩個(gè)品種差別較大。主要體現(xiàn)在?；ㄉ盏谋磉_(dá)?！R瑟蘭’?；ㄉ罩饕远谆ù渌氐南愣辊；问酱嬖?，占整體花色苷的34.82%，而二甲花翠素的?；ㄉ照?7.04%?！嘞贾椤汀∥秲憾唷鄬?duì)含量組成相差不大，?；ㄉ罩饕远谆ù渌氐囊阴；癁橹?，分別占26.26%和24.54%。相比于‘馬瑟蘭’而言，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷-對(duì)香豆酸的相對(duì)含量較低，分別為11.64%和11.77%。除卻三個(gè)相對(duì)含量較高的花色苷，其余花色苷的相對(duì)百分含量均在7%以下，且不同品種之間占比不同。

表2 三個(gè)釀酒葡萄品種葡萄皮中花色苷數(shù)量 （單位：種）Table 2 Number of anthocyanins in grape skins from three wine grape varieties (Unit: types)

表3 三個(gè)釀酒葡萄品種?；惢ㄉ障鄬?duì)含量 （單位：%）Table 3 The relative content of acylated anthocyanins in three wine grape varieties（Unit: %）

2.3 五種基本花色苷含量對(duì)比分析

由表5可知，三個(gè)釀酒葡萄品種中5種基本花色苷含量高低順序不盡相同，但含量最高的均是二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷。其中‘小味兒多’為1155.5 mg/kg，‘馬瑟蘭’為1064.86 mg/kg，‘赤霞珠’最低為699.06 mg/kg。除了二甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷，‘馬瑟蘭’的其余四種基本花色苷含量均為最低。不僅如此，‘馬瑟蘭’中并未檢測(cè)到花青素-3-O-葡萄糖苷，而其他兩個(gè)品種中該花色苷含量也是最低。其中‘小味兒多’含量最高也僅為24.03 mg/kg，而‘赤霞珠’為16.85 mg/kg?？傮w可以看出，基本花色苷總量順序?yàn)椋盒∥秲憾啵抉R瑟蘭＞赤霞珠。

3 討論與結(jié)論

表4 三個(gè)釀酒葡萄品種葡萄皮花色苷相對(duì)百分含量 （單位：%）Table 4 Relative percentages of anthocyanins in grape skins of three wine grape varieties (Unit: %)

表5 三種釀酒葡萄中5種基本花色苷含量 （單位：mg/kg）Table 5 Five basic anthocyanins in three wine grapes (Unit: mg/kg)

本次試驗(yàn)利用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)同一基地的三個(gè)釀酒葡萄品種花色苷進(jìn)行分離測(cè)定，探究了不同品種間花色苷組成及含量的差異。其中共檢測(cè)到15種花色苷組分，三個(gè)品種花色苷單體數(shù)量不盡相同。‘馬瑟蘭’的香豆?；ㄉ蘸扛撸嘞贾椤汀∥秲憾唷阴；ㄉ蘸扛摺Ｈ齻€(gè)品種花色苷五種基本花色苷總量排列順序?yàn)樾∥秲憾啵抉R瑟蘭＞赤霞珠，均以二甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量最高，占花色苷總量的30%以上。

煙臺(tái)地區(qū)與甘肅及山西地區(qū)相比[17,20]，煙臺(tái)地區(qū)釀酒葡萄的?；惢ㄉ账急壤^高，穩(wěn)定性更好。但花色苷的含量偏低，這可能與樹齡和氣候有較大關(guān)系，七八月份氣溫偏高，溫差較小，前期旱中間澇后期旱，導(dǎo)致根系新梢長(zhǎng)勢(shì)較差，影響了花色苷的積累，而具體原因需進(jìn)一步考究。