吳三英 譚曉霞 毛其芬

作者單位：1浙江省麗水市婦幼保健院檢驗(yàn)科（麗水 323000）；2浙江省立同德醫(yī)院檢驗(yàn)科（杭州 310012）

宮頸癌是發(fā)病率很高的婦科腫瘤，好發(fā)于40歲以下女性，手術(shù)和化療目前仍是治療宮頸癌的主要手段[1]。順鉑是一種廣譜抗腫瘤化療藥物，對肺癌、結(jié)腸癌和宮頸癌等多種腫瘤都有療效[2-3]。然而大劑量順鉑的副反應(yīng)大，特別是耳毒性和腎毒性不容忽視[4-5]。本文探討黃芩素對順鉑抗宮頸癌作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料 DMEM培養(yǎng)基（批號12491）購于美國Gibco公司。Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（批號APOAF）、噻唑藍(lán)（MTT，批號 M2128）、黃芩素（批號275667）和順鉑（批號 2210000）購于美國 Sigma-Aldrich。長壽因子 1（SIRT1）抗體（批號 2493）、p53 抗體（批號 2527）、乙?；?p53抗體（批號 2525）、p53上調(diào)凋亡調(diào)節(jié)因子（Puma）抗體（批號12450）、活化型半胱天冬酶3（caspase-3）（批號39661）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（批號5174）購于美國Cell Signaling公司。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物（ECL）試劑盒（批號 32106）購于美國 Pierce。脂質(zhì)體 2000（批號11668019）購于美國 Invitrogen。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌細(xì)胞系Hela購于美國模式培養(yǎng)物典藏所（ATCC）。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于37°C恒溫培養(yǎng)箱中并通入5%CO2。

1.3 SIRT1質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 人SIRT1基因的開放閱讀框架序列經(jīng)PCR擴(kuò)增后以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構(gòu)建成SIRT1重組過表達(dá)質(zhì)粒。SIRT1過表達(dá)質(zhì)粒用脂質(zhì)體2000按試劑操作說明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，簡要步驟如下：將2μg/mL質(zhì)粒用脂質(zhì)體2000進(jìn)行包裹后將其加入到無血清培養(yǎng)基進(jìn)行混合。將貼壁的Hela細(xì)胞置于該無血清培養(yǎng)基孵育6h后棄去無血清培養(yǎng)基并加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。

1.4 細(xì)胞活力檢測 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的Hela細(xì)胞按5×103/孔接種在96孔板上，分為對照組、黃芩素組、順鉑組、順鉑+黃芩素組和順鉑+黃芩素+SIRT1質(zhì)粒組。對照組為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞不加藥物培養(yǎng)48h，順鉑組為在空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞中加入2μmol/L的順鉑培養(yǎng)48h，黃芩素組為在空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞中加入10μmol/L的黃芩素培養(yǎng)48h，順鉑+黃芩素組為在空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞中加入2μmol/L的順鉑和10μmol/L的黃芩素培養(yǎng)48h，順鉑+黃芩素+SIRT1質(zhì)粒組為在SIRT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞中加入2μmol/L順鉑和10μmol/L黃芩素培養(yǎng)48h。藥物處理完畢后在Hela培養(yǎng)孔中加入20μL 5mg/mL MTT再培養(yǎng)4h，小心吸去上清液，孔中加入150μL二甲亞砜，充分震蕩后在570nm波長下用酶標(biāo)儀檢測OD值。Hela細(xì)胞活力抑制率計(jì)算公式：抑制率=（對照組OD-藥物處理組OD）/對照組OD×100%。

1.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的Hela細(xì)胞按2×106/孔接種在6孔板上，按1.4進(jìn)行分組處理。處理完畢后按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書用Annexin-V對細(xì)胞進(jìn)行染色孵育20min。之后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測Hela細(xì)胞的凋亡，凋亡誘導(dǎo)率用Annexin-V陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比表示。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的Hela細(xì)胞按2×106/孔接種在6孔板上，按1.4進(jìn)行分組處理。藥物處理完畢后將細(xì)胞用蛋白提取液提取總蛋白質(zhì)。之后將提取的總蛋白質(zhì)用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到醋酸纖維素膜上，用SIRT1抗體、p53抗體、乙酰化p53抗體、Puma抗體、活化型半胱天冬酶3和GAPDH抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） ，應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組Hela細(xì)胞細(xì)胞活力抑制率、凋亡誘導(dǎo)率比較 MTT和流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，順鉑+黃芩素組Hela細(xì)胞細(xì)胞活力抑制率和凋亡誘導(dǎo)率均顯著高于順鉑組和黃芩素組（P＜0.05），見表 1。

表1 各組Hela細(xì)胞細(xì)胞活力抑制率和凋亡誘導(dǎo)率比較（%，±s）

表1 各組Hela細(xì)胞細(xì)胞活力抑制率和凋亡誘導(dǎo)率比較（%，±s）

注：與順鉑組比較，*P＜0.05；與黃芩素組比較，△P＜0.05；與順鉑+黃芩素組比較，▲P＜0.05

組別對照組順鉑組黃芩素組順鉑+黃芩素組順鉑+黃芩素+SIRT1質(zhì)粒組孔數(shù)3 3 3 3 3細(xì)胞活力抑制率0 18.1±1.4 5.8±0.5 66.3±5.7*△25.7±2.1▲凋亡誘導(dǎo)率1.6±0.2 10.4±0.9 2.8±0.3 38.4±3.2*△14.5±1.1▲

2.2 黃芩素通過下調(diào)Hela細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平提高其對順鉑治療的敏感性 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩素處理能明顯抑制Hela細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平，而順鉑處理對SIRT1表達(dá)水平無影響，見圖1（插頁）。為了探討黃芩素發(fā)揮順鉑增效作用的機(jī)制是否和SIRT1的下調(diào)有關(guān)，筆者在Hela細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SIRT1質(zhì)粒使SIRT1蛋白強(qiáng)制高表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩素和順鉑聯(lián)合能顯著降低轉(zhuǎn)染SIRT1質(zhì)粒的Hela細(xì)胞細(xì)胞活力抑制率和凋亡誘導(dǎo)率（P＜0.05），見表1。

2.3 黃芩素通過SIRT1/p53途徑增強(qiáng)順鉑對Hela細(xì)胞的殺傷活性 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，順鉑處理能誘導(dǎo)Hela細(xì)胞p53的表達(dá)和乙?；剑S芩素單獨(dú)處理雖不能直接誘導(dǎo)p53的活化，但能明顯促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的p53的乙?；捅磉_(dá)水平的增加。然而轉(zhuǎn)染SIRT1表達(dá)質(zhì)粒后，黃芩素對順鉑誘導(dǎo)的p53的促進(jìn)作用受到明顯抑制，見圖2（插頁），表明黃芩素通過下調(diào)SIRT1的表達(dá)促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的p53的乙?；捅磉_(dá)水平的增加。另外，Hela細(xì)胞p53下游蛋白Puma在黃芩素和順鉑的聯(lián)合作用下，表達(dá)水平顯著提高，同時(shí)，黃芩素聯(lián)合順鉑能顯著誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡執(zhí)行分子caspase-3的活化，而轉(zhuǎn)染SIRT1質(zhì)粒后，Puma蛋白表達(dá)和caspase-3的活化均受到顯著抑制，見圖3（插頁）。

3 討論

黃芩素是從天然藥物黃芩根部提取的主要活性成分，具有抗過敏、抗菌、抗病毒的功效，近期研究還發(fā)現(xiàn)黃芩素具有一定的腫瘤抑制作用[6]，本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素聯(lián)合處理能顯著提高宮頸癌細(xì)胞在順鉑治療下的細(xì)胞活力抑制率和凋亡誘導(dǎo)率（P＜0.05），表明黃芩素能作為一種輔助治療藥物增強(qiáng)順鉑對宮頸癌細(xì)胞的殺傷活性，降低順鉑的使用劑量。

SIRT1是一種組蛋白去乙?；?，在結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌和宮頸癌等多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)生過表達(dá)[7-10]。腫瘤細(xì)胞中的SIRT1能使p53、p73和FOXO等轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生去乙?；顾鼈兪セ钚裕瑥亩种拼俚蛲龅鞍妆磉_(dá)對抗化療藥物誘導(dǎo)的凋亡[11-13]，因此SIRT1是提高腫瘤細(xì)胞化療敏感性的潛在靶點(diǎn)。在SIRT1依賴的抗凋亡通路中，p53的去乙?；l(fā)揮了重要作用。p53是細(xì)胞中一種不穩(wěn)定蛋白，然而p53能在DNA發(fā)生損傷（順鉑治療）時(shí)發(fā)生乙?；揎棧阴；膒53能穩(wěn)定存在并具有轉(zhuǎn)錄活性，能誘導(dǎo)下游Puma等促凋亡蛋白的表達(dá)而使細(xì)胞發(fā)生凋亡[14-15]。然而SIRT1的高度表達(dá)能通過減弱p53的穩(wěn)定性從而保護(hù)腫瘤細(xì)胞逃避藥物誘導(dǎo)的凋亡信號。

本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素對順鉑協(xié)同抗宮頸癌活性依賴于細(xì)胞SIRT1的抑制。黃芩素通過抑制SIRT1表達(dá)從而減弱順鉑誘導(dǎo)的乙酰化p53發(fā)生去乙?；Щ?，使Puma等下游促凋亡蛋白發(fā)生過表達(dá)而使宮頸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡性死亡。