石佳娜 葉佐武 徐金波 魯春芳 楊秀麗

作者單位：1浙江省人民醫(yī)院藥學部（杭州 310014）；2杭州醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院藥學部（杭州 310014）；3浙江省立同德醫(yī)院藥學部（杭州310012）

糖尿病是胰島素抵抗和胰島素缺乏導致的以高血糖為主要特征的代謝紊亂綜合征，易引起心、腦、腎等并發(fā)癥。糖尿病狀態(tài)下血漿游離脂肪酸異常增高，心肌耗能增加，葡萄糖代謝下降，脂肪酸代謝增加，心臟內(nèi)過量的脂肪酸攝取和氧化導致心肌內(nèi)脂肪代謝產(chǎn)物的積聚，引起心臟脂質(zhì)毒性，并在此基礎(chǔ)上出現(xiàn)氧化應激，導致細胞凋亡、內(nèi)皮功能紊亂、炎癥反應增加，同時出現(xiàn)心肌的損傷，心肌的結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生改變[1-2]。項目組前期實驗發(fā)現(xiàn)生脈飲能改善糖尿病心肌脂質(zhì)代謝[3]，為更進一步研究其作用機制，本實驗擬采用Western blotting方法研究生脈飲改善鏈脲佐菌素（STZ）誘導糖尿病模型大鼠心肌脂質(zhì)代謝的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 Wistar大鼠72只，雄性，SPF級，6周齡，體質(zhì)量160～180g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001。

1.2 藥品與試劑 生脈飲（江西濟民藥業(yè)，批號130201，規(guī)格 10mL/支）；鏈脲佐菌素（STZ）（美國sigma公司，批號031M1287V）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH（美國sigma公司，批號G5265）；磷酸腺苷蛋白激酶（AMPK）抗體（Cell Signaling Technology公司，批號 2532）；乙酰輔酶 A羧化酶（ACC）抗體（Abcam公司，批號ab45174）；羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMG-CoA）抗體（Abcam公司，批號ab174830）；脂肪酸合成酶（FAS）抗體（Bioworld Technology公司，批號A0461）；核轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白（SREBP1）抗體（Abcam 公司，批號 ab28481）；飲用水（杭州祥符水廠）。

1.3 儀 器 5810R離心機，德國Eppendorf公司；Cobas c311血液生化儀，德國羅氏公司；蛋白質(zhì)電泳及電轉(zhuǎn)移裝置，北京六一儀器廠；臺式酶標儀，Bio-Tek公司；凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司。

2 實驗方法

2.1 動物模型制作 參照文獻[4]方法，建立糖尿病大鼠模型，大鼠腹腔注射35mg/kg STZ。繼續(xù)喂養(yǎng)1周后，測定空腹血糖，連續(xù)2次血糖≥l6.7mmol/L且有多飲、多食、多尿，表示造模成功。

2.2 分組與給藥 72只雄性Wistar大鼠隨機分成對照組、模型組、生脈飲預防組、生脈飲高、中、低劑量組六組，每組12只。對照組和模型組均給予飲用水12mL/kg灌胃，預防組造模前4周開始給予生脈飲12mL/kg灌胃，高、中、低劑量治療組在造模成功后分別給予12、6、3mL/kg生脈飲灌胃，預防組合計灌胃19周，其余各組均連續(xù)灌胃15周。造模與給藥期間，對照組給予普通飼料，其余各組均喂養(yǎng)高脂高熱量飼料。

2.3 心臟系數(shù)及生化指標測定 各組給藥結(jié)束后，大鼠禁食10h，腹腔注射10%水合氯醛0.35g/kg麻醉，腹主動脈取血，靜置1h后分離血清，-20℃凍存待檢。自動生化儀測定低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、載脂蛋白 A（ApoAⅠ）、載脂蛋白 B（ApoB）。處死大鼠后迅速取出心臟，用冷等滲鹽水洗凈，濾紙吸干，稱重并記錄，心臟系數(shù)=心臟質(zhì)量/動物質(zhì)量；將心臟標本編號后立即置入-80℃液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 Western blotting檢測心肌脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白將心肌組織剪碎、碾磨后，細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，按步驟進行蛋白提取和濃度測定，將樣本蛋白溶液分裝，使每分裝管中含有20～40μg的蛋白量，分裝后-80℃凍存?zhèn)溆?。取分裝好的蛋白樣本，補加三蒸水和 loading buffer（5×）至相同體積（一般為 10μL），煮沸5min使蛋白變性，上樣。跑膠用聚丙烯酰胺凝膠電泳（1×Running buffer電泳，先 70V，30min，待樣本跑至濃縮膠和分離膠交界處時，改為110V，90 min，直至溴酚藍跑至膠外）。進行轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育后，采用ECL化學發(fā)光法檢測印跡膜，ECL試劑盒A液和B液按1:1比例混合，滴于干凈玻璃紙上，將膜用吸水紙吸干后正面向著AB混合液，孵育1 min，置于曝光盒中，在膜的位置上覆蓋上X光膠片，曝光后，取出膠片，放入膠片沖印機中，約3min后觀察結(jié)果。產(chǎn)物條帶用Gel Doc 2000型凝膠成像系統(tǒng)分析記錄結(jié)果。檢測磷酸腺苷蛋白激酶（AMPK）信號通路相關(guān)乙酰輔酶A羧化酶（ACC）、脂肪酸合成酶（FAS）、核轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白（SREBP1）、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMG-CoA）蛋白。

2.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0軟件，計量資料以均值±標準差（±s） 表示，采用One-way ANOVA檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠心臟系數(shù)比較 模型組心臟系數(shù)高于對照組，生脈飲各劑量組心臟系數(shù)均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01），且存在量效關(guān)系。見表1。

3.2 各組大鼠血脂比較 生脈飲預防組、高劑量組LDL低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。生脈飲預防組及各劑量組HDL高于對照組、模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。生脈飲預防組和各劑量組ApoAⅠ/ApoB均高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表 2。

3.3 各組大鼠心肌磷酸腺苷蛋白激酶（AMPK）信號通路相關(guān)蛋白比較

3.3.1 各組大鼠心肌磷酸化（p）-AMPK蛋白比較Western blotting結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌磷酸化p-AMPK表達較對照組低（P＜0.05），而生脈飲預防組能上調(diào)p-AMPK的蛋白表達（P＜0.05）。見圖1。

3.3.2 各組大鼠心肌ACC、HMG-CoA蛋白比較Western blotting結(jié)果顯示，生脈飲干預能下調(diào)糖尿病模型大鼠心肌 ACC（P＜0.05）、HMG-CoA（P＞0.05）蛋白表達。見圖 2、3。

3.3.3 各組大鼠心肌FAS、SREBP1蛋白比較 Westen blotting結(jié)果顯示，生脈飲干預能下調(diào)糖尿病模型大鼠心肌 FAS（P＜0.05）、SREBP1（P＞0.05）蛋白的表達。見圖 4、5。

表1 各組大鼠心臟系數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠心臟系數(shù)比較（±s）

注：與對照組比較，△△P＜0.01，與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別對照組模型組生脈飲預防組生脈飲高劑量組生脈飲中劑量組生脈飲低劑量組鼠數(shù)12 12 12 12 12 12心臟系數(shù)（×100）0.2512±0.0196 0.3589±0.0164△△0.3236±0.0075**0.3274±0.0016**0.3328±0.0146**0.3400±0.0009*

圖1 生脈飲對糖尿病模型大鼠心肌p-AMPK蛋白的影響

4 討論

表2 各組大鼠血脂比較（±s）

表2 各組大鼠血脂比較（±s）

注：與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；LDL：低密度脂蛋白；HDL：高密度脂蛋白；TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；ApoAⅠ：載脂蛋白A；ApoB：載脂蛋白B

組別對照組模型組生脈飲預防組生脈飲高劑量組生脈飲中劑量組生脈飲低劑量組鼠數(shù)12 12 12 12 12 12 TG（mmol/L）1.53±0.63 3.26±2.22#3.35±1.98 3.44±1.74 2.28±1.43 3.19±1.36 TC（mmol/L）2.06±0.51 2.34±0.34 2.42±0.57 2.59±0.59 2.30±0.74 2.90±0.56 HDL（mmol/L）1.55±0.24 1.65±0.41 2.12±0.27**△△2.09±0.34*△2.21±0.32**△△2.48±0.34**△△LDL（mmol/L）0.25±0.096 0.42±0.14△△0.28±0.14*0.25±0.10*0.30±0.16 0.36±0.16 ApoAⅠ/ApoB 1.014±0.450 0.588±0.242△0.917±0.204*2.000±0.577**1.278±0.565**1.333±0.500**

《傷寒論》記載：“消渴，氣上撞心，心中痛熱”，“消渴病心積”。消渴病病久入絡(luò)，損傷心絡(luò)，導致陰陽氣血虧虛，臟腑功能失調(diào)；中醫(yī)認為，陰虛為消渴致病之本，兼夾濕熱、燥熱、瘀熱等為病之標；益氣養(yǎng)陰，化瘀通絡(luò)為主要治法之一。生脈飲由黨參、麥冬、五味子組成，具有益氣復脈、養(yǎng)陰生津的功能；用于氣陰兩虧，心悸氣短，脈微自汗。研究發(fā)現(xiàn)[5-7]生脈膠囊可改善慢性心衰心室重構(gòu)，生脈注射液可提高糖尿病大鼠的血管內(nèi)皮功能，改善心功能。

圖2 生脈飲對糖尿病模型大鼠心肌ACC蛋白的影響

圖3 生脈飲對糖尿病模型大鼠心肌HMG-CoA蛋白的影響

圖4 生脈飲對糖尿病模型大鼠心肌FAS蛋白的影響

圖5 生脈飲對糖尿病模型大鼠心肌SREBP1蛋白的影響

研究[8]發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者心肌細胞內(nèi)脂質(zhì)水平是健康人的5～6倍。糖尿病狀態(tài)下，由于胰島素抵抗，心肌細胞中葡萄糖底物減少且脂肪酸水平增高，對脂肪細胞抑制減弱，脂肪酸的攝取超過了氧化的速度，導致脂質(zhì)在心肌細胞內(nèi)堆積[9-10]。研究[11-12]表明，AMPK激活（磷酸化）后才能增強組織對葡萄糖的攝取、脂肪酸的氧化及胰島素敏感性，并可減少葡萄糖的輸出及異生，減少膽固醇和甘油三酯的生成。AMPK在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中起著重要作用：（1）抑制脂肪酸及膽固醇的合成。ACC和HMG-CoA是AMPK的兩個靶蛋白，分別是脂肪酸和膽固醇合成過程中的關(guān)鍵酶?；罨腁MPK可使其磷酸化，抑制其功能，從而對抑制肝脂肪酸和膽固醇的合成起關(guān)鍵作用。（2）增加脂肪酸氧化。激活的AMPK可以通過磷酸化作用抑制ACC，減少丙二酰輔酶A的合成，導致脂肪酸的氧化增強。（3）抑制脂解作用[11]。（4）AMPK激活后可通過抑制SREBP1而抑制FAS的活性，從而抑制脂肪酸的合成[12]。

本實驗顯示，生脈飲可能通過磷酸化激活AMPK，通過調(diào)節(jié) AMPK 下游 ACC、SREBP、HMG-CoA、FAS等蛋白，從而改善糖尿病大鼠的脂質(zhì)代謝。表明生脈飲改善STZ誘導糖尿病大鼠心肌脂質(zhì)代謝作用可能與AMPK有關(guān)。但由于中藥化學成分多且復雜，作用機制復雜，量效關(guān)系難以控制，本論文研究結(jié)果僅可為生脈飲改善糖尿病心肌脂質(zhì)代謝提供思路和方法，為AMPK相關(guān)機制的進一步明確提供實驗依據(jù)。