肖懿峰　袁逸銘

【摘 要】目的：分析Fgl2基因?qū)9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響與機(jī)制。方法：利用空白試劑、陰性病毒以及Fgl2siRNA慢病毒對(duì)H9C2心肌細(xì)胞進(jìn)行感染。將其分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組以及Fgl2siRNA組，然后經(jīng)過48小時(shí)后，利用Wsetern印跡對(duì)各組細(xì)胞內(nèi)的Fgl2蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)；對(duì)酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)；利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組的Fgl2蛋白表達(dá)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而Fgl2siRNA組的Fgl2蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；酶切caspase3的蛋白表達(dá)下降，Notch1以及Hesl的蛋白表達(dá)上升，都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Fgl2組的H9C2細(xì)胞凋亡降低趨勢(shì)較為明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論：Fgl2基因?qū)9C2心肌細(xì)胞的凋亡具有明顯抑制作用，而其機(jī)制與下調(diào)酶切caspase3蛋白表達(dá)以及激活Notch1信號(hào)通路有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】Fgl2基因；心肌細(xì)胞；凋亡影響；纖維蛋白原樣

【中圖分類號(hào)】R542.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1672-3783（2018）06-03--01

經(jīng)過相關(guān)的醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，心肌疾病中都會(huì)出現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡，而心肌細(xì)胞凋亡會(huì)引起各種慢性心力衰竭、心室重塑等病癥。因此，抑制心肌細(xì)胞凋亡對(duì)心肌疾病具有一定的預(yù)防效果。對(duì)心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)行抑制可以改善心肌生存環(huán)境，減輕心臟重塑，有助于心肌疾病的后續(xù)治療。而Fgl2基因是一種纖維蛋白原樣，主要表達(dá)在T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞中，它是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要功能為調(diào)節(jié)免疫與凝血。

1 研究材料與研究方法

1.1 研究材料

此次試驗(yàn)研究過程中主要使用的研究材料為H9C2心肌細(xì)胞株，是從中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫中選購的。研究過程中使用的主要研究試劑包括：（1）RPMI1640培養(yǎng)基與胎牛血清；（2）陰性病毒、Fgl2 siRNA慢?。唬?）二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒以及電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒；（4）細(xì)胞凋亡試劑盒、酶切caspase3、Notch1以及Hesl抗體。而研究中使用的儀器主要有：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、流式細(xì)胞儀、電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)以及聚丙烯酰胺凝膠電泳儀。

1.2 研究方法

研究過程包括細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染以及效果檢測(cè)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)、Wsetern印跡檢測(cè)酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表達(dá)。（1）細(xì)胞培養(yǎng)。取出心肌細(xì)胞凍存管放入37℃水中解凍，并要輕輕晃動(dòng)凍存管，加速解凍過程。解凍完成后，將心肌細(xì)胞放在含有10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：37℃、5%CO2以及飽和濕度為95%的恒溫培養(yǎng)箱。第二天更換培養(yǎng)液。按照實(shí)驗(yàn)需要傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行研究。（2）細(xì)胞轉(zhuǎn)染及效果檢測(cè)。以1×105個(gè)/孔對(duì)生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的心肌細(xì)胞進(jìn)行接種，使用的細(xì)胞培養(yǎng)板為6孔。細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到60%時(shí)，要及時(shí)更換培養(yǎng)基，對(duì)空白試劑組、陰性病毒組以及Fgl2 siRNA組對(duì)心肌細(xì)胞的感染程度進(jìn)行檢測(cè)。取48小時(shí)后的細(xì)胞，向內(nèi)加入PMSF和RIPA裂解液，然后放在4℃冰上反應(yīng)30分鐘，使用每分鐘12000轉(zhuǎn)的離心15分鐘，收集蛋白。用BCA試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量。然后取出50微克蛋白樣品使用12%十二烷基硫酸與聚丙烯酰胺凝膠電泳儀進(jìn)行分離，電泳結(jié)束后使用PVDF轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，加入一抗（1：400稀釋的Fgl2和1：1000稀釋的GAPDH），放置于4℃環(huán)境中孵育。第二天用TBST洗膜（3次，每次5分鐘），然后加入1：1000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記過的羊抗鼠IgG，在室溫中孵育1小時(shí)，再次進(jìn)行TBST洗膜，利用ECL化學(xué)發(fā)光劑顯色，在室溫避光環(huán)境中完成顯影與定影。以GAPDH為參照，對(duì)Fgl2的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行對(duì)比分析。（3）細(xì)胞凋亡檢測(cè)。主要利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，然后對(duì)心肌細(xì)胞的凋亡率進(jìn)行計(jì)算分析。（4）Wsetern印跡檢測(cè)酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表達(dá)。取出經(jīng)過轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的各組細(xì)胞，利用BCA試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè)，然后檢測(cè)酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表達(dá)。

2 研究結(jié)果

使用SPSS21.0軟件對(duì)研究資料進(jìn)行差異比較，兩組比較結(jié)果用t檢驗(yàn)。此次研究中，空白對(duì)照組、陰性病毒對(duì)照組以及Fgl2 siRNA組的結(jié)果分別為：（1）Fgl2蛋白表達(dá)水平?？瞻讓?duì)照組與陰性病毒組的蛋白表達(dá)為[（0.445±0.051）VS（0.442±0.050）]，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而Fgl2 siRNA組的蛋白表達(dá)水平為（0.182±0.028），明顯低于空白對(duì)照組與陰性病毒組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）心肌細(xì)胞凋亡情況?？瞻讓?duì)照組與陰性病毒組的細(xì)胞凋亡分別為[（1.25±0.28）%]、[（1.24±0.29）%]，而Fgl2 siRNA組的細(xì)胞凋亡為[（5.76±0.57）%]，降低趨勢(shì)明顯。（3）酶切easpase3，Noteh1，Hesl蛋白表達(dá)情況。Fgl2 siRNA組的酶切easpase3蛋白明顯下調(diào)表達(dá)，而Notchl，Hesl蛋白明顯上升。

3 結(jié)論

一直以來心血管疾病都是威脅人類健康的重要疾病，而患者在發(fā)病過程中因心肌缺血缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、心室擴(kuò)張、心臟重塑等癥，最終導(dǎo)致患者心力衰竭。本次研究顯示，沉默F(xiàn)gl2表達(dá)可以明顯降低H9C2細(xì)胞的凋亡。而caspase家族是細(xì)胞凋亡的重要通路，其中caspase3是多種凋亡刺激信號(hào)的最終匯集點(diǎn)，它的活性是細(xì)胞凋亡進(jìn)行不可逆階段的標(biāo)志，根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)easpase3表達(dá)能夠降低心肌細(xì)胞的凋亡。所以，沉默F(xiàn)gl2表達(dá)可以借助抑制酶切easpase3表達(dá)實(shí)現(xiàn)降低心肌細(xì)胞凋亡的目的。而Fgl2表達(dá)激活Notch1信號(hào)通路，可以限制心肌細(xì)胞的凋亡，為治療心血管疾病提供理論基礎(chǔ)。

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